CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。

CRISPR系统在疾病诊疗中的应用:基于文献计量学视角

CRISPR系统作为一种新的基因编辑工具,在疾病的基因诊疗领域受到了越来越多的关注.文章利用R语言文献计量学软件BiblioShiny,以“CRISPR”和“disease”为主题检索Web of Science数据库,选取2018年1月至2024年6月刊发的9839篇文献进行计量学分析.结果表明,近年来聚焦在该领域的研究文献丰富且逐年稳步递增,CRISPR系统中的新技术(如单碱基编辑,先导编辑)和新靶点(如干细胞,动物模型)等为热点研究方向,CRISPR系统已广泛应用于神经系统疾病、骨骼肌肉系统疾病、血液系统疾病、眼部疾病、癌症和病毒感染等疾病治疗中.

CRISPR/Cas系统中工程化gRNA技术的研究和应用

CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达。作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域。随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力。基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性。

大学生行为抑制激活系统与情绪和正念的关系

目的:探讨大学生行为抑制/激活系统与情绪的关系及正念各因素在其关系间的作用。方法:选取268名大学生,采用行为抑制/激活系统量表、积极情绪和消极情绪量表和正念五因素量表进行测查。运用线性回归分析与非参数Bootstrap法探讨正念各因素在行为抑制/激活系统与情绪关系间的中介作用。结果:描述和不行动因子在行为激活系统与积极情绪的关系中的起中介作用(效应值为0.04、0.02),觉知地行动、不判断和不行动因子在行为抑制系统与消极情绪的关系中起中介作用(效应值为0.09、0.06、0.04)。结论:行为抑制/激活系统分别与消极情绪、积极情绪有关;正念作为特殊的情绪调节策略,各因子在其中发挥着独特的中介作用。

CRISPR/Cas系统在微藻基因编辑研究中的进展

微藻是一类在显微镜下才能辨别的微小藻类群体,其结构简单,分布广泛,常见的微藻有蓝藻、螺旋藻、莱茵衣藻、杜氏盐藻等[1]。微藻是一类比陆生作物拥有更高生物量的单细胞光合自养生物,富含蛋白质、脂肪酸、维生素和色素等生物活性物质,在生物燃料、天然产物增产、功能性藻株制备、环境治理、温室效应调节等方面均发挥着重要作用,有着重要的学术研究和开发应用价值[2]。

基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证

目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

大学生行为抑制系统和行为激活系统对抑郁影响的中介效应分析

目的探究大学生行为抑制系统(BIS)、行为激活系统(BAS)与抑郁、述情障碍之间的关系,并分析述情障碍在BIS、BAS和抑郁关系中的作用。方法2022年5月通过线上问卷星平台向四川、深圳等地高校大学生发放量表,包括BIS、BAS量表和Beck抑郁量表(BDI)及述情障碍量表(BVAQ),共对1152名高校大学生进行调查。结果大学生抑郁与BIS呈正相关(r=0.392,P<0.001),与BAS呈负相关(r=-0.268,P<0.001);述情障碍与抑郁呈负相关(r=-0.206,P<0.001),与BIS(r=0.123,P<0.001)、BAS(r=0.339,P<0.001)呈正相关;大学生BIS(β=0.413,P<0.001)、BAS(β=-0.200,P<0.001)直接影响抑郁,述情障碍在行为系统与抑郁之间起中介作用。结论大学生BIS正向影响抑郁、BAS负向影响抑郁,且述情障碍在其BIS、BAS以及抑郁之间起中介作用。

基于CRISPR/Cas9系统的Met-mcherry果蝇制备及其表达分析

保幼激素(juvenile hormone,JH)作为昆虫变态发育中的关键激素,其核内信号的传递主要依赖于胞内受体Methoprene-tolerant(Met)。JH生理功能的发挥取决于Met的组织定位。然而,受限于Met抗体的制备,目前有关Met的组织定位仍无法确定。实验采用CRISPR/Cas9系统,将红色荧光蛋白(mcherry)编码序列插入Met基因C末端,使果蝇表达Met-mcherry融合蛋白,构建获得原位表达Met-mcherry的果蝇品系。利用mcherry抗体从而可真实准确地反应Met的时空表达情况。免疫荧光染色结果发现游走早期,Met-mcherry主要定位于果蝇唾液腺、触角盘、前胸腺、脂肪体、神经索、腿盘等组织中。亚细胞定位结果表明,在果蝇游走期和产卵后96 h,Met-mcherry分别定位于细胞核和细胞质中,并且JH可促进Met-mcherry由细胞质转移至细胞核中。研究可为深入了解Met的功能提供基础。

高效特异的CRISPR/dCas9转录激活系统——flySAM系统

随着人类等物种的基因组计划的完成,关于基因组的研究已经从结构基因组学转向了功能基因组学。将基因组的序列信息转化为功能信息,解密生命的密码,完成基因组的功能注释对于全面理解生长发育、疾病衰老、学习记忆等过程具有重大意义。

第三代基因编辑技术CRISPR对人体免疫系统的相关改造以优化癌症治疗方案

本文主要通过阅读相关文献中提及的癌症治疗中应用第三代基因编辑技术CRISPR以完善治疗方法,提高治疗有效程度的案例,在CRISPR对免疫细胞相关机制和作用进行基因重编程这个大的课题框架中总结出三个分支,分别是增强癌细胞抗原呈递,减轻免疫抑制,体外重编程免疫细胞并分析其相关的副作用有以及改善措施,以此总结支持后续癌症相关实验设计以及未来治疗方向。

基于CRISPR/Cpf1系统下的诱导型多基因激活体系的建立

为开发高效率的内源多基因激活工具,利用CRISPR/Cpf1系统能够促使pre-crRNA中多个crRNA自我剪切和释放的特性,将As/Fn/LbCpf1的核酸酶区域定点突变形成dCpf1,并在C端和N端分别引入了VPR三元转录激活域和不稳定结构域(DD-domain)、四环素控制的操纵子,构建了TRE3G-DD-dCpf1-VPR激活系统.结果显示,Oct4基因的转录水平提升高达104倍,且Myod1、Oct4基因的转录水平分别在Dox和TMP单药的控制下,能够实现不同程度的转录水平的提升,在加双药的条件下Myod1、Oct4基因可分别提高80、120多倍.证明该系统能够通过靶向DNA快捷、高效的进行诱导内源性多基因激活.

CRISPR/Cas9基因编辑系统在作物抗性品种选育中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术因周期短、效率及精确度高、载体构建简单等优点,成为目前作物抗性品种选育的最佳分子育种工具。概述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基本原理,分析总结了该系统在作物抗旱性、抗盐性、抗冷性、抗重金属盐及抗除草剂品种选育中的应用,以期为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术选育更多优质作物抗性品种提供参考。

CRISPR系统转化医学研究进展

CRISPR系统作为在现今科学研究中对基因编辑运用广泛的一项技术,在后基因组学时代对于基因功能研究、疾病发生发展机制以及基因靶向药物等研究具有重要意义。目前人们运用CRISPR/Cas9编辑技术成功构建细胞和模式生物模型用于临床医学研究。CRISPR/Cas9作为一类强大的基因编辑技术不单只运用于基因功能缺失或外源基因敲入等研究中,CRISPR基因敲除文库筛选系统、CRISPR/dCas9基因激活系统、CRISPR干扰技术和CRISPR分子诊断技术等CRISPR转化医学研究将CRISPR应用于基因高通量筛选、基因沉默导致疾病发生、跨表观遗传修饰激活基因表达、可逆性干扰靶标基因表达以及运用CRISPR分子诊断检测病原微生物感染性疾病等临床研究中,推动生命科学和临床医学等多学科的发展。针对CRISPR系统在转化医学中的研究应用进行阐述。

CRISPR／Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术,与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas系统更简单,并且更容易操作。文章重点介绍了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理及这一技术在基因组定点修饰中的应用,剖析了该技术可能存在的问题,展望了CRISPR/Cas系统的应用前景,为开展这一领域的研究工作提供参考。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。

行为抑制/激活系统量表中文版的信效度分析

目的:考察Carver和White的行为抑制/激活系统量表中文版的信度和效度。方法:采用行为抑制/激活系统量表、艾森克人格问卷和状态-特质焦虑量表对262名大学生进行调查。结果:(1)项目分析显示,除题项1和18,其余题目的鉴别度均符合心理测量学要求。(2)探索性因素分析(各因素条目负荷分别为0.69-0.83,0.59-0.80,0.36-0.59,0.41-0.72)和验证性因素分析均显示四因素结构更为合理(RMSEA=0.042,GFI=0.926,AGFI=0.902,IFI=0.891,CFI=0.887,AIC=280.349)。(3)行为抑制系统与神经质呈中度相关(r=0.53,P<0.01),行为激活-驱力与外向性呈中度相关(r=0.30,P<0.01);特质焦虑与行为抑制系统呈中度相关(r=0.35,P<0.01),与行为激活系统三个维度无显著相关。显示量表有较好的聚合和区分效度。(4)四个因素的Cronbachα系数分别为0.59、0.72、0.66和0.55。结论:行为抑制/激活系统量表中文版是比较可靠和有效的测试人格建构的量表。

CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的应用

CRISPR/Cas9系统是2012年发展起来由RNA导向的基因组编辑技术。相比ZFN和TALENs技术,CRISPR/Cas9系统具有类似的打靶效率,且更易于操作。通过将核酸酶Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可以获得失去切割活性的dCas9蛋白。借助导向RNA将dCas9与DNA特定位点结合的作用,可以实现抑制或激活基因转录,从而达到对特定基因表达进行调控的目的。本文主要从作用原理、影响因素等方面综述了CRISPR/Cas9系统在基因调控中的应用,以期为相关研究提供参考。

CRISPR-Cas系统与细菌和噬菌体的共进化

细菌在适应噬菌体攻击的过程中,进化了多种防御系统,噬菌体在细菌的选择压力下,也在不断进化反防御策略,双方的这种进化关系与发生机制一直尚不完全清楚。近年在细菌和古细菌中发现一种新的免疫防御系统,即CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated system)系统。在对其功能和作用机制深入研究的同时,也不断地揭示了细菌和噬菌体之间的共进化关系。为此,文章在介绍原核细胞中CRISPR-Cas系统介导的免疫机制基础上,重点综述了CRISPR系统在细菌和噬菌体进化中的作用。

甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统研究评价

依据80—90年代国际关于甲壳动物免疫机制的资料，对甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统的研究进展予以综合评价，目的在于为中国科技工作者防治虾蟹类疾病提供参考。现有的研究表明，甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统可被微生物多糖激活，在激活过程中产生一系列活性物质，通过多种形式参与宿主防御反应。在甲壳动物中，与proPO系统有关的因子正在被逐步纯化出来。proPO可由内源蛋白酶转化成活性形式，存在调节因子调节proPO系统的释放与激活。与proPO系统有关的两种蛋白即76kD蛋白和BGBP－L直接参与细胞间信息传递。该系统在甲壳动物的识别、防卫及细胞间信息传递中发挥着重要作用。

CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低,对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难,位点特异性核酸酶的出现和应用,大大提升了同源重组的效率,使基因组编辑变得更加高效和精确,从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶(ZFN)和TALE核酸酶(TALENs)是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统,但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足,如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等,另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前,该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前,CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限,但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理,进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用,主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望,希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。