CRISPR-Cas13a系统在病原体检测应用中的最新研究进展

规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统已作为近年来兴起的新一代分子诊断工具,被广泛应用于基因编辑、核酸检测等领域,其中Cas13a亚型因其在核酸检测中高特异度、高灵敏度、无需昂贵设备、操作简单、费用低廉等特点,在病原体检测领域展现出巨大的潜力。该文综述了CRISPR-Cas13a的作用机制、在病原体检测中的应用以及相关检测方法,并对Cas13a应用前景进行了展望。以期为CRISPR-Cas13a系统的进一步研究及其在病原体检测中的应用提供借鉴和参考。

CRISPR-Cas13a检测在肺结核诊断中的价值

目的:评价应用CRISPR-Cas13a检测临床样本对肺结核的诊断价值。方法:采用回顾性研究方法,收集首都医科大学附属北京胸科医院2022年9月至2022年12月收治住院的102例经GeneXpert MTB/RIF检测(简称“Xpert检测”)确诊的肺结核患者的支气管肺泡灌洗液标本,作为结核病组;收集同期收治入院的100例非结核病患者(包括肺癌,细菌性肺炎,支气管扩张,慢性阻塞性肺疾病)的支气管肺泡灌洗液标本,作为非结核病组。所有患者的支气管肺泡灌洗液标本均进行涂片抗酸杆菌染色镜检、培养、Xpert检测及CRISPR-Cas13a检测。以Xpert检测结果为参照,评价CRISPR-Cas13a检测支气管肺泡灌洗液对肺结核的诊断价值。结果:结核病组102份标本中,CRISPR-Cas13a检测阳性为99份(97.1%),涂片阳性40份(39.2%),培养阳性68份(66.7%)。CRISPR-Cas13a检测阳性率明显高于涂片和培养法,差异有统计学意义(涂片:χ^(2)=58.141,P<0.001;培养:χ^(2)=30.250,P<0.001)。与传统检测方法相比,CRISPR-Cas13a比涂片和培养法多检测出28份标本。Xpert检测结核病组阳性率为100.0%;Xpert检测非结核病组阴性率为100.0%。以Xpert检测结果作为参照,CRISPR-Cas13a检测肺结核的敏感度为97.1%(99/102)、特异度为96.0%(96/100),准确度为96.5%(195/202),阳性预测值为96.1%(99/103),阴性预测值为97.0%(96/99)。结论:CRISPR-Cas13a检测与传统方法相比简单、快捷,检测支气管肺泡灌洗液对肺结核的诊断具有较高敏感度及特异度,具有良好的应用前景。

PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究

目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMDTM19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-1crRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-1crRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为101拷贝/μl的质粒和100拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于106拷贝/μl的MTB DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均=-9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

CRISPR-Cas13a抑制RNA病毒的多靶标基因编辑技术构建

CRISPR-Cas适应性免疫系统为细菌和古细菌免受外来核酸和噬菌体的侵害提供了保护。其中2类VI-A型CRISPR-Cas效应子Cas13a(之前称为C2c2),可受CRISPR RNA的引导,靶向切割与原始间隔区反向互补的单链RNA。本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a系统,多靶标编辑烟草花叶病毒(TMV)RdRP、MP和CP基因,以抑制病毒在寄主烟草体内的侵染与扩散,从而达到保护寄主的作用。该系统在瞬时表达测定中表现出对野生型TMV-U1和表达绿色荧光蛋白的TMV-30b的干扰以及对病毒累积和病毒病症状的抑制。靶向TMV RdRP基因的CRISPR RNA表现出比靶向MP和CP基因更好的编辑效能。经过适当设计的CRISPR-Lsh-Cas13a系统被赋予了广谱抗性,可以特异性编辑多种TMV菌株。研究表明,CRISPR-Cas13a系统可以用于针对RNA病毒的抑制干扰。

基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒cccDNA检测方法临床应用评价

目的 评价基于CRISPR-Cas13a技术的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)检测方法的应用价值。方法 收集25例HBV感染患者和5例非HBV感染患者的肝组织标本,提取肝组织的总DNA,依次使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)消化;设计HBV cccDNA的特异性引物,扩增消化后的产物;利用CRISPR/Cas13a技术建立CRISPR-HBV cccDNA检测方法,通过HBV cccDNA质粒和临床样本对该方法进行评价,并利用数字PCR和荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的方法检测HBV cccDNA质粒的灵敏度为1 copies/μL,显著高于数字PCR(10 copies/μL,P<0.01)和荧光定量PCR(10^(3)copies/μL,P<0.01);建立的方法检测HBV cccDNA阳性样本的灵敏度为1 copies/μL,与数字PCR相同,高于荧光定量PCR(10 copies/μL,P<0.01);建立的方法对25例HBV感染的临床肝组织样本的检出阳性率为80%,均高于数字PCR(64%)和荧光定量PCR(48%)。结论 本研究建立的CRISPR-HBV cccDNA检测方法在乙肝患者肝组织标本HBV cccDNA检测中具有较高的灵敏度,为评价乙肝患者的临床治疗效果和监测停药复发等情况提供了有效帮助。

PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统对MTB DNA检测方法的初步研究

目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。

CRISPR-Cas13a system: a novel approach to precision oncology

A paper titled"The CRISPR-Cas13 a gene-editing system induces collateral cleavage of RNA in glioma cells",recently published in Advanced Science by the Kang group,reports the promising application of the CRISPR-Cas13 a system in cancer cells1.

CRISPR-Cas13a系统在基因编辑和分子诊断领域中的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一个强大的基因编辑工具。相对于Cas9,Cas13a可靶向多基因转录产物,从而调控基因功能表达,填补了Cas9仅限于DNA水平的编辑及脱靶效应等缺陷。不仅如此,利用Cas13a靶向RNA的特性,该系统被成功地改造成下一代核酸诊断工具。文章概述了CRISPR-Cas13系统在基因编辑及分子诊断领域的最新研究进展,并对该系统的应用前景进行了展望。

重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H74种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检测。

木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。

CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

利用CRISPR-Cas9技术编辑OsBADH2基因改良优质恢复系桂恢852的香味品质

【目的】利用CRISPR-Cas9技术编辑桂恢852的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2),以期快速改良广西优质恢复系桂恢852的香味品质,为广西香稻新种质的创制提供亲本资源及技术参考。【方法】以广西优质非香型水稻桂恢852为材料,对其OsBADH2蛋白的序列特征、保守结构域、保守基序、系统发育进化等进行分析,再根据CRISPR-GE网站信息挑选合适的靶位点,分别构建OsBADH2基因第1、2外显子的双突载体pLM62和第7外显子的单突载体pLM63。利用CRISPR-Cas9技术和水稻遗传转化技术靶向敲除桂恢852的OsBADH2基因,获取不同类型的osbadh2突变体。以桂恢852为对照,通过咀嚼法鉴定突变体osbadh2是否具有香味。最后,通过农艺性状测定和单因素方差分析,判断OsBADH2基因突变是否影响农艺性状。【结果】OsBADH2基因序列全长为6268 bp,包含15个外显子和14个内含子,其编码区(CDS)为1512 bp,编码503个氨基酸残基,具有1个典型的Aldedh结构域(第16~485位氨基酸),属于醛脱氢酶,其蛋白序列与结构相对保守。通过OsBADH2氨基酸序列的BLAST比对分析,分别获得水稻的3个高相似性蛋白和拟南芥的4个高相似性蛋白,其中水稻OsBADH1、OsBADH2、OsALDH2B2、OsALDH2C1及拟南芥BADH1、BADH2、AL2C4均属于ALDH-SF(Aldehyde dehydrogenase superfamily)超家族成员。OsBADH2与OsBADH1为旁系同源基因,与拟南芥中BADH1和BADH2为直系同源基因。在桂恢852的遗传背景下成功获得4种突变类型且不含T-DNA的纯合突变体株系(osbadh2-1~osbadh2-4)。这4种突变类型均会使OsBADH2基因发生移码突变,导致翻译过程提前终止,破坏OsBADH2蛋白的原有结构和功能,导致4个osbadh2突变体株系的稻米产生香气。4个osbadh2突变体株系的株高、有效穗数、穗长、结实率、千粒重、长宽比与桂恢852野生型间无显著差异(P>0.05),但osbadh2-2突变体与osbadh2-4突变体的结实率存在极显著差异(P<0.01)。【结论】桂恢852的4个osbadh2突变体株系均具有香味品质,且综合农艺性状与野生型无显著差异,表明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能快速定向改变水稻品种的目标性状,极大缩短了育种年限。

CRISPR-Cas基因编辑技术在羊生产应用中研究进展

基因编辑是一种能够进行基因组修饰的基因工程技术。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)作为新发展起来的一种强大的基因编辑工具,因具有高效性、精确性和灵活性而被广泛应用。CRISPR-Cas系统通过在特定基因组位点引入插入、缺失或单碱基替换等方式实现位点的特异性修饰,在畜牧生产的诸多领域做出了重大贡献。在羊生产应用方面,通过建立改善生产经济性状和抗病性的绵山羊动物模型,可以对关键基因的功能进行研究,从而加速性状的改良。本文主要综述了CRISPR-Cas系统的机制与功能及其在羊繁殖性状、肉用性状、产毛性状、泌乳性状和抗病性状生产应用与创建羊动物模型方面的研究进展。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展

近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)系统在内的基因编辑工具使生物体的基因组DNA靶向修饰成为可能,尤其是CRISPR-Cas9系统的出现,加速了基因编辑技术的发展,成为基础科学和应用科学中的革命性工具。与ZFNs和TALENs技术相比,CRISPR-Cas9系统因其高灵活性、灵敏度、特异性和成本效益而被广泛使用。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过靶向特定序列精确地切割DNA,并通过在特定基因组位点产生双链断裂来添加、去除或替换核苷酸等方式在位点引入特异性修饰对畜牧生产的不同方面做出了重大贡献,产生了改善牲畜生产和具有抗病性等多种动物模型,以研究畜禽关键基因功能,加速性状改良。作者主要阐述了CRISPR-Cas9系统的机制与功能及其在牛、羊生产中的应用进展,以期为今后的相关研究提供参考。

基于CRISPR-Cas12a核酸检测研究进展

由病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他病原微生物引起的疾病对人类健康构成极大威胁,如果能在疾病早期检测出来,就能够对传染性疾病起到关键的预防作用。近些年来,CRISPR-Cas系统在检测病原方面已被广泛应用,其中CRISPR-Cas12a弥补了Cas9的不能多点编辑的缺陷和Cas12a靶向DNA的特性,成为了热门的核酸检测工具。论文综述了Cas12a与Cas9的不同之处、Cas12a的发现、CRISPR-Cas12a的信号检测平台以及目前使用的检测方法。

CRISPR-Cas系统检测病原菌的研究进展

环境和食品中的病原菌威胁着人类和动物的生命健康,影响社会安定与经济发展。早期准确并快速检测病原菌,对监测和治疗人类与动物疾病起至关重要的作用。目前的病原菌检测技术主要包括分离培养鉴定法、免疫诊断方法以及基于核酸的分子生物学诊断技术。以上检测方法的特异性和准确性高,但存在检测周期长、对检测人员和设备的要求高等问题,亟待开发更加快速稳定、价廉简便的高灵敏度与高特异性的新型快速检测技术。近年来,以成簇的有规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统(CRISPR-Cas)系统为代表的新型基因编辑技术发展迅速。CRISPR-Cas系统不仅能够作为基因编辑工具,也在不同生物学领域中广泛应用,其中基于CRISPR-Cas系统开发的病原菌检测平台具有灵敏度高、特异性强、灵活性高、成本低廉、快速稳定等优势,在病原菌的快速检测方面具有较大潜力。本文旨在对近几年基于CRISPR-Cas系统开发的多种病原菌检测平台进行综述,包括CRISPR-Cas系统的基本作用原理及相关系统在各种病原菌检测中的应用,并展望其未来所面临的技术挑战与发展前景。

小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。

基于CRISPR-Cas9系统构建LEU1基因缺失酿酒酵母用于酿造低醉酒度米酒

为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)系统构建LEU1基因缺失的酿酒酵母XF0-L。将出发菌株XF0和重组菌株XF0-L进行培养基模拟发酵和米酒发酵,测定发酵酒的理化指标和高级醇含量。结果表明,菌株XF0-L与XF0模拟发酵酒的理化指标无显著差异(P>0.05),说明LEU1基因的缺失对酿酒酵母发酵性能无影响。相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L模拟发酵酒中正丙醇(26.27 mg/L)和异丁醇含量(88.64 mg/L)分别提高21.96%和85.25%,异戊醇含量(141.82 mg/L)、异戊醇/正丙醇(5.39)、异戊醇/异丁醇(1.60)分别降低15.53%、30.99%、54.42%;相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L发酵米酒中正丙醇(268.67 mg/L)和异丁醇含量(992.33 mg/L)分别提高14.17%、52.90%,异戊醇含量(1016.33 mg/L)、异戊醇/正丙醇(3.78)、异戊醇/异丁醇(1.02)分别降低13.58%、24.40%、43.65%,说明重组菌株XF0-L能够显著降低发酵酒中的异戊醇/正丙醇、异戊醇/异丁醇从而降低醉酒度(P<0.05)。

基于CRISPR-Cas系统的分子诊断应用研究进展

CRISPR-Cas系统是细菌抵御噬菌体入侵的适应性免疫系统,按照其效应蛋白的不同分为两大类。其在特异性识别切割目标序列的基础上,还附带有切割周围单链DNA和RNA分子的反式切割特性,这种特异的识别机制为分子诊断带来了新机会,本文简单介绍了CRISPR-Cas的机制和类型,重点关注已经用于分子诊断的CRISPR-Cas系统,列举了其应用和相关研究进展。