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Systematic screening for potential therapeutic targets in osteosarcoma through a kinome-wide CRISPR-Cas9 library 被引量:2
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作者 Yuanzhong Wu Liwen Zhou +4 位作者 Zifeng Wang Xin Wang Ruhua Zhang Lisi Zheng Tiebang Kang 《Cancer Biology & Medicine》 SCIE CAS CSCD 2020年第3期782-794,共13页
Objective:Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor.However,the survival of patients with osteosarcoma has remained unchanged during the past 30 years,owing to a lack of efficient therapeutic target... Objective:Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor.However,the survival of patients with osteosarcoma has remained unchanged during the past 30 years,owing to a lack of efficient therapeutic targets.Methods:We constructed a kinome-targeting CRISPR-Cas9 library containing 507 kinases and 100 nontargeting controls and screened the potential kinase targets in osteosarcoma.The CRISPR screening sequencing data were analyzed with the Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR/Cas9 Knockout(MAGeCK)Python package.The functional data were applied in the 143B cell line through lenti-CRISPR-mediated gene knockout.The clinical significance of kinases in the survival of patients with osteosarcoma was analyzed in the R2:Genomics Analysis and Visualization Platform.Results:We identified 53 potential kinase targets in osteosarcoma.Among these targets,we analyzed 3 kinases,TRRAP,PKMYT1,and TP53RK,to validate their oncogenic functions in osteosarcoma.PKMYT1 and TP53RK showed higher expression in osteosarcoma than in normal bone tissue,whereas TRRAP showed no significant difference.High expression of all 3 kinases was associated with relatively poor prognosis in patients with osteosarcoma.Conclusions:Our results not only offer potential therapeutic kinase targets in osteosarcoma but also provide a paradigm for functional genetic screening by using a CRISPR-Cas9 library,including target design,library construction,screening workflow,data analysis,and functional validation.This method may also be useful in potentially accelerating drug discovery for other cancer types. 展开更多
关键词 OSTEOSARCOMA KINASE crispr-cas9 library TRRAP PKMYT1 TP53RK
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Protein stability regulators screeningassay (Pro-SRSA): protein degradation meets theCRISPR-Cas9 library 被引量:1
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作者 Yuanzhong Wu Tiebang Kang 《Chinese Journal of Cancer》 SCIE CAS CSCD 2016年第8期385-387,共3页
The regulation of protein stability is a fundamental issue for biophysical processes,but there has not previously been a convenient and unbiased method of identifying regulators of protein stability.However,as reporte... The regulation of protein stability is a fundamental issue for biophysical processes,but there has not previously been a convenient and unbiased method of identifying regulators of protein stability.However,as reported in the article entitled "A genome-scale CRISPR-Cas9 screening method for protein stability reveals novel regulators of Cdc25 A," recently published in Cell Discovery,our team developed a protein stability regulators screening assay(Pro-SRSA) by combining the whole-genome clustered regularly interspaced short palindromic repeats Cas9(CRISPR-Cas9) library with a dual-fluorescence-based protein stability reporter and high-throughput sequencing to screen for regulators of protein stability.Based on our findings,we are confident that this efficient and unbiased screening method at the genome scale will be used by researchers worldwide to identify regulators of protein stability. 展开更多
关键词 crispr-cas9 screening Protein stability Cdc25A Ubiquitination ACETYLATION
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木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建
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作者 蔡吉苗 李博勋 +3 位作者 黄贵修 李超萍 时涛 王国芬 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第8期1528-1537,共10页
MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放... MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。 展开更多
关键词 木薯 MeMLO12基因 克隆 表达分析 crispr-cas9载体 构建
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利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响 被引量:1
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作者 满建呈 成娟 赵丽 《中国实验血液学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第1期52-56,共5页
目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系... 目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。 展开更多
关键词 急性髓系白血病 HOXA5基因 crispr-cas9
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利用CRISPR-Cas9技术编辑OsBADH2基因改良优质恢复系桂恢852的香味品质
5
作者 齐金岗 陈颖 +5 位作者 刘开强 王小姣 李林娟 赵丽冰 李孝琼 郭嗣斌 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2058-2068,共11页
【目的】利用CRISPR-Cas9技术编辑桂恢852的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2),以期快速改良广西优质恢复系桂恢852的香味品质,为广西香稻新种质的创制提供亲本资源及技术参考。【方法】以广西优质非香型水稻桂恢852为材料,对其OsBADH2蛋白... 【目的】利用CRISPR-Cas9技术编辑桂恢852的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2),以期快速改良广西优质恢复系桂恢852的香味品质,为广西香稻新种质的创制提供亲本资源及技术参考。【方法】以广西优质非香型水稻桂恢852为材料,对其OsBADH2蛋白的序列特征、保守结构域、保守基序、系统发育进化等进行分析,再根据CRISPR-GE网站信息挑选合适的靶位点,分别构建OsBADH2基因第1、2外显子的双突载体pLM62和第7外显子的单突载体pLM63。利用CRISPR-Cas9技术和水稻遗传转化技术靶向敲除桂恢852的OsBADH2基因,获取不同类型的osbadh2突变体。以桂恢852为对照,通过咀嚼法鉴定突变体osbadh2是否具有香味。最后,通过农艺性状测定和单因素方差分析,判断OsBADH2基因突变是否影响农艺性状。【结果】OsBADH2基因序列全长为6268 bp,包含15个外显子和14个内含子,其编码区(CDS)为1512 bp,编码503个氨基酸残基,具有1个典型的Aldedh结构域(第16~485位氨基酸),属于醛脱氢酶,其蛋白序列与结构相对保守。通过OsBADH2氨基酸序列的BLAST比对分析,分别获得水稻的3个高相似性蛋白和拟南芥的4个高相似性蛋白,其中水稻OsBADH1、OsBADH2、OsALDH2B2、OsALDH2C1及拟南芥BADH1、BADH2、AL2C4均属于ALDH-SF(Aldehyde dehydrogenase superfamily)超家族成员。OsBADH2与OsBADH1为旁系同源基因,与拟南芥中BADH1和BADH2为直系同源基因。在桂恢852的遗传背景下成功获得4种突变类型且不含T-DNA的纯合突变体株系(osbadh2-1~osbadh2-4)。这4种突变类型均会使OsBADH2基因发生移码突变,导致翻译过程提前终止,破坏OsBADH2蛋白的原有结构和功能,导致4个osbadh2突变体株系的稻米产生香气。4个osbadh2突变体株系的株高、有效穗数、穗长、结实率、千粒重、长宽比与桂恢852野生型间无显著差异(P>0.05),但osbadh2-2突变体与osbadh2-4突变体的结实率存在极显著差异(P<0.01)。【结论】桂恢852的4个osbadh2突变体株系均具有香味品质,且综合农艺性状与野生型无显著差异,表明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能快速定向改变水稻品种的目标性状,极大缩短了育种年限。 展开更多
关键词 水稻 恢复系 香味 OsBADH2 crispr-cas9
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CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展
6
作者 潘东霞 王辉 +1 位作者 熊本海 唐湘方 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期4880-4889,共10页
近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clus... 近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)系统在内的基因编辑工具使生物体的基因组DNA靶向修饰成为可能,尤其是CRISPR-Cas9系统的出现,加速了基因编辑技术的发展,成为基础科学和应用科学中的革命性工具。与ZFNs和TALENs技术相比,CRISPR-Cas9系统因其高灵活性、灵敏度、特异性和成本效益而被广泛使用。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过靶向特定序列精确地切割DNA,并通过在特定基因组位点产生双链断裂来添加、去除或替换核苷酸等方式在位点引入特异性修饰对畜牧生产的不同方面做出了重大贡献,产生了改善牲畜生产和具有抗病性等多种动物模型,以研究畜禽关键基因功能,加速性状改良。作者主要阐述了CRISPR-Cas9系统的机制与功能及其在牛、羊生产中的应用进展,以期为今后的相关研究提供参考。 展开更多
关键词 crispr-cas9系统 基因编辑 繁殖 泌乳 抗病
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小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化
7
作者 开朗 杨昊 +1 位作者 朱道君 陈旭升 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期10-17,共8页
小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为... 小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。 展开更多
关键词 放线菌 小白链霉菌 crispr-cas9系统 基因敲除
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基于CRISPR-Cas9系统构建LEU1基因缺失酿酒酵母用于酿造低醉酒度米酒
8
作者 王泽翔 何娇娇 +1 位作者 梁思宇 周世水 《中国酿造》 CAS 北大核心 2024年第4期62-67,共6页
为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋... 为探究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)异丙基苹果酸合成酶基因LEU1的缺失对酿造米酒生成高级醇的影响,该研究构建重组质粒p414-Cas9-BleoR和p426-gRNA.LEU1-kanMX后电转化酿酒酵母XF0,利用成簇规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)系统构建LEU1基因缺失的酿酒酵母XF0-L。将出发菌株XF0和重组菌株XF0-L进行培养基模拟发酵和米酒发酵,测定发酵酒的理化指标和高级醇含量。结果表明,菌株XF0-L与XF0模拟发酵酒的理化指标无显著差异(P>0.05),说明LEU1基因的缺失对酿酒酵母发酵性能无影响。相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L模拟发酵酒中正丙醇(26.27 mg/L)和异丁醇含量(88.64 mg/L)分别提高21.96%和85.25%,异戊醇含量(141.82 mg/L)、异戊醇/正丙醇(5.39)、异戊醇/异丁醇(1.60)分别降低15.53%、30.99%、54.42%;相较于出发菌株XF0,重组菌株XF0-L发酵米酒中正丙醇(268.67 mg/L)和异丁醇含量(992.33 mg/L)分别提高14.17%、52.90%,异戊醇含量(1016.33 mg/L)、异戊醇/正丙醇(3.78)、异戊醇/异丁醇(1.02)分别降低13.58%、24.40%、43.65%,说明重组菌株XF0-L能够显著降低发酵酒中的异戊醇/正丙醇、异戊醇/异丁醇从而降低醉酒度(P<0.05)。 展开更多
关键词 酿酒酵母 crispr-cas9 LEU1基因 高级醇 低醉酒度米酒
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Generation of double knockout cattle via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein(RNP)electroporation
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作者 Gyeong-Min Gim Kyeong-Hyeon Eom +10 位作者 Dong-Hyeok Kwon Dae-Jin Jung Dae-Hyun Kim Jun-Koo Yi Jae-Jung Ha Ji-Hyun Lee Seong-Beom Lee Woo-Jae Son Soo-Young Yum Won-Wu Lee Goo Jang 《Journal of Animal Science and Biotechnology》 SCIE CAS CSCD 2024年第1期456-462,共7页
Background Genome editing has been considered as powerful tool in agricultural fields.However,genome editing progress in cattle has not been fast as in other mammal species,for some disadvantages including long gestat... Background Genome editing has been considered as powerful tool in agricultural fields.However,genome editing progress in cattle has not been fast as in other mammal species,for some disadvantages including long gestational periods,single pregnancy,and high raising cost.Furthermore,technically demanding methods such as microinjection and somatic cell nuclear transfer(SCNT)are needed for gene editing in cattle.In this point of view,electroporation in embryos has been risen as an alternative.Results First,editing efficiency of our electroporation methods were tested for embryos.Presence of mutation on embryo was confirmed by T7E1 assay.With first combination,mutation rates for MSTN and PRNP were 57.6%±13.7%and 54.6%±13.5%,respectively.In case of MSTN/BLG,mutation rates were 83.9%±23.6%for MSTN,84.5%±18.0%for BLG.Afterwards,the double-KO embryos were transferred to surrogates and mutation rate was identified in resultant calves by targeted deep sequencing.Thirteen recipients were transferred for MSTN/PRNP,4 calves were delivered,and one calf underwent an induction for double KO.Ten surrogates were given double-KO embryos for MSTN/BLG,and four of the six calves that were born had mutations in both genes.Conclusions These data demonstrated that production of genome edited cattle via electroporation of RNP could be effectively applied.Finally,MSTN and PRNP from beef cattle and MSTN and BLG from dairy cattle have been born and they will be valuable resources for future precision breeding. 展开更多
关键词 BETA-LACTOGLOBULIN CATTLE crispr-cas9 ELECTROPORATION KNOCKOUT MSTN PRNP
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CRISPR-Cas9基因编辑技术及其在家禽中的研究进展
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作者 肖怡梦 杨雯 +1 位作者 程依依 罗刚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期38-47,共10页
CRISPR-Cas系统是细菌或古细菌内抵御病毒再次入侵的一种适应性免疫系统,能够对靶向核酸进行切割。基于Cas9蛋白及其突变体的特性,科学家开发出多样化的基因编辑工具,能够对细胞内的基因进行敲除或敲入等基因编辑操作,实现生物的遗传变... CRISPR-Cas系统是细菌或古细菌内抵御病毒再次入侵的一种适应性免疫系统,能够对靶向核酸进行切割。基于Cas9蛋白及其突变体的特性,科学家开发出多样化的基因编辑工具,能够对细胞内的基因进行敲除或敲入等基因编辑操作,实现生物的遗传变异;或对DNA或RNA进行表观修饰,调控基因的表达,已广泛地应用于生命科学的研究。禽类是农业中的重要物种,为人类提供优质的蛋白质。在禽类的基因组编辑和修饰中,CRISPR-Cas9技术仍处于研究状态,且只在鸡和鹌鹑两种家禽上取得实质性进展。本文从CRISPR-Cas9系统的组成成分、传递方法、优化策略介绍了CRISPR-Cas9基因编辑技术及其在家禽生产和疾病防控中的应用,为进一步开发适用于家禽体系的CRISPR-Cas9提供理论基础。 展开更多
关键词 家禽 crispr-cas9 育种 诊断
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T7E1检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验设计 被引量:2
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作者 王宏刚 魏远 +1 位作者 李艳君 朱玉山 《实验技术与管理》 CAS 北大核心 2023年第5期38-41,共4页
CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系,使实验教学贴近科研实际,提升实验课程教学质量,设计了T7核酸内切酶1(T7E1)检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn... CRISPR-Cas9是一种现代生命科学研究中普遍使用的新型基因编辑技术。为了升级课程内容体系,使实验教学贴近科研实际,提升实验课程教学质量,设计了T7核酸内切酶1(T7E1)检测CRISPR-Cas9基因编辑效果实验。以CRISPR-Cas9基因编辑技术对mfn1编辑过的HeLa细胞为实验材料,提取基因组DNA,PCR扩增mfn1基因片段,切胶回收后,变性,退火,使用T7E1对编辑效果进行检测。经1%琼脂糖凝胶电泳,可观察到T7E1将略大于500 bp的mfn1基因片段切成两条大小约为250 bp的DNA片段,表明CRISPR-Cas9成功地对mfn1进行了编辑。 展开更多
关键词 T7核酸内切酶1 crispr-cas9 实验教学 科研反哺教学
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基于CRISPR-Cas9技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系 被引量:2
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作者 王强州 潘诗雨 +4 位作者 方梦雅 李微 王佳兴 刘茵茵 陈世豪 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期227-233,共7页
为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序... 为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,TET2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建TET2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡TET2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA,构建sgRNA表达质粒,连同Cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA的DF-1细胞,进行流式细胞分选,获取表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞,再通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后,Western blot和Dot blot检测TET2蛋白的表达水平和羟甲基化(5hmC)水平。DNA测序结果表明,TET2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变,引起TET2蛋白移码突变,将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上,细胞形态稳定。Western blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞几乎不表达TET2蛋白。Dot blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除TET2基因的鸡胚成纤维细胞系,为研究鸡TET2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 TET2 crispr-cas9 TET2基因敲除 鸡胚成纤维细胞
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CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作 被引量:3
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作者 吴仲胜 高誉 +2 位作者 杜勇涛 党颂 何康敏 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期165-175,共11页
CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式... CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。 展开更多
关键词 crispr-cas9基因编辑 活细胞 内源蛋白 荧光蛋白 自标记蛋白标签
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利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系 被引量:2
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作者 韦新宇 曾跃辉 +5 位作者 杨旺兴 肖长春 候新坡 黄建鸿 邹文广 许旭明 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期2144-2159,共16页
稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明... 稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T0代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T1代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T2代植株表型性状、稻米蒸煮食味品质和外观品质指标进行了考察和测定分析。结果表明,所有指标在两组材料间均无显著差异。进一步采用测交和回交转育方法并结合Badh2位点测序分析,成功选育获得了其对应的纯合香型三系不育系明太A-badh2。通过与恢复系明恢703、明恢3009测配,其组合产量与国家审定品种明太优703、明太优3009相近且表现出较强的超标优势。此外,通过与香型恢复系明恢1831测配后发现其组合籽粒中香味物质2-AP含量极显著高于对照组合明太A/明恢1831。因此,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,可对水稻香味基因Badh2进行精准定向编辑和敲除,实现对水稻香味性状的改良,为创制香型籼稻不育系提供理论指导,从而加快香型杂交稻育种进程。 展开更多
关键词 水稻 crispr-cas9 基因编辑 香味 Badh2 2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)
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基于小分子化学反应工具构建CRISPR-Cas9功能调控体系的研究进展
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作者 孔好 徐菲洋 +1 位作者 王依香 张艳 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第3期109-118,共10页
CRISPR技术是目前基因编辑领域的一大研究热点,已在疾病治疗、作物改良等领域得到广泛的应用,CRISPR-Cas9系统是其中研究最为深入的一种类型.如何降低Cas9/sgRNA复合物在细胞内作用的脱靶性是CRISPR-Cas9技术发展面临的主要挑战之一.利... CRISPR技术是目前基因编辑领域的一大研究热点,已在疾病治疗、作物改良等领域得到广泛的应用,CRISPR-Cas9系统是其中研究最为深入的一种类型.如何降低Cas9/sgRNA复合物在细胞内作用的脱靶性是CRISPR-Cas9技术发展面临的主要挑战之一.利用光或活性小分子诱发的小分子化学反应工具构建CRISPRCas9功能调控体系,通过对sgRNA,Cas9或Cas9/sgRNA复合物的功能进行调控,可以在细胞乃至活体水平上一定程度实现对CRISPR-Cas9作用的时间或空间特异性的操纵,大大降低非特异性基因编辑作用发生的概率,同时小分子对原体系的干扰较小,因此小分子化学反应逐渐成为操纵CRISPR-Cas9体系的一种重要的研究工具.本文总结和介绍了小分子反应工具用于CRISPR-Cas9功能调控系统构建的主要研究进展,并对其未来的发展进行了展望. 展开更多
关键词 基因编辑 crispr-cas9 脱靶作用 小分子化学反应 功能调控体系
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Modernising autism spectrum disorder model engineering and treatment via CRISPR-Cas9:A gene reprogramming approach 被引量:1
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作者 Arushi Sandhu Anil Kumar +3 位作者 Kajal Rawat Vipasha Gautam Antika Sharma Lekha Saha 《World Journal of Clinical Cases》 SCIE 2023年第14期3114-3127,共14页
A neurological abnormality called autism spectrum disorder(ASD)affects how a person perceives and interacts with others,leading to social interaction and communication issues.Limited and recurring behavioural patterns... A neurological abnormality called autism spectrum disorder(ASD)affects how a person perceives and interacts with others,leading to social interaction and communication issues.Limited and recurring behavioural patterns are another feature of the illness.Multiple mutations throughout development are the source of the neurodevelopmental disorder autism.However,a well-established model and perfect treatment for this spectrum disease has not been discovered.The rising era of the clustered regularly interspaced palindromic repeats(CRISPR)-associated protein 9(Cas9)system can streamline the complexity underlying the pathogenesis of ASD.The CRISPR-Cas9 system is a powerful genetic engineering tool used to edit the genome at the targeted site in a precise manner.The major hurdle in studying ASD is the lack of appropriate animal models presenting the complex symptoms of ASD.Therefore,CRISPR-Cas9 is being used worldwide to mimic the ASD-like pathology in various systems like in vitro cell lines,in vitro 3D organoid models and in vivo animal models.Apart from being used in establishing ASD models,CRISPR-Cas9 can also be used to treat the complexities of ASD.The aim of this review was to summarize and critically analyse the CRISPRCas9-mediated discoveries in the field of ASD. 展开更多
关键词 Autism spectrum disorder crispr-cas9 Cellular models ORGANOIDS Animal models Therapeutic strategies
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基因编辑工具CRISPR-Cas9与CRISPR-Cas12a的比较与应用 被引量:1
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作者 王炀坤 纪世新 +2 位作者 苏莹莹 孙英旗 宋相伟 《长春师范大学学报》 2023年第12期107-112,共6页
基因编辑技术的突飞猛进,使得生物体的遗传与改造技术具有空前的深度与广度。基因编辑技术中的CRISPR-Cas系统由于其在检测、诊断方面的高灵活性、敏感性和特异性而为人们所熟知。CRISPR-Cas系统中的Class2是由单个多域蛋白组成的效应模... 基因编辑技术的突飞猛进,使得生物体的遗传与改造技术具有空前的深度与广度。基因编辑技术中的CRISPR-Cas系统由于其在检测、诊断方面的高灵活性、敏感性和特异性而为人们所熟知。CRISPR-Cas系统中的Class2是由单个多域蛋白组成的效应模块,Class2中的CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a是广泛应用的基因编辑工具。对CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的作用机制和应用领域进行比较,以便更好应用该项技术。 展开更多
关键词 crispr-cas9 crispr-cas12a 作用机制
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CRISPR-Cas9高通量文库筛选技术在胶质瘤中的应用进展
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作者 濮蓓 张旭 +2 位作者 熊晓星 简志宏 曾智 《医学综述》 CAS 2023年第13期2568-2573,共6页
胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤,其治疗以手术切除、术后辅助放化疗为主,但效果不理想,预后较差。成簇间隔规律短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(Cas9)高通量文库筛选技术以合成致死治疗策略为基础,通过CRISPR-Cas9技术对胶质瘤... 胶质瘤是最常见的神经系统肿瘤,其治疗以手术切除、术后辅助放化疗为主,但效果不理想,预后较差。成簇间隔规律短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(Cas9)高通量文库筛选技术以合成致死治疗策略为基础,通过CRISPR-Cas9技术对胶质瘤细胞进行基因编辑,将单向导RNA转入细胞中,在全基因组范围内干扰基因功能并筛选目的表型,以获得一系列与肿瘤发生发展机制及治疗相关的靶基因。目前,CRISPR-Cas9高通量文库筛选技术在胶质瘤中被广泛研究,已在细胞模型、动物模型等模型中获得了一系列与胶质瘤增殖、药物敏感性及耐药相关的靶基因,这可为后续临床胶质瘤的个体化靶向治疗提供新的指导方向,以得到更好的临床治疗效果。 展开更多
关键词 胶质瘤 成簇间隔规律短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9 合成致死 高通量文库筛选
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基因编辑技术CRISPR-Cas9在畜禽改良领域的应用 被引量:2
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作者 房玮 郭佳朋 +3 位作者 王梓桢 连洋 王溪 樊国翔 《农业与技术》 2023年第12期105-108,共4页
基因编辑技术是一种新兴的基因改良方法,其可以精准地修改生物体的基因序列,从而改变生物体性状。在畜禽改良领域,CRISPR-Cas9技术可以被用来改良畜禽的生长速度、肉质品质、疾病抗性等。本文将从CRISPR-Cas9技术在畜禽改良方面的应用... 基因编辑技术是一种新兴的基因改良方法,其可以精准地修改生物体的基因序列,从而改变生物体性状。在畜禽改良领域,CRISPR-Cas9技术可以被用来改良畜禽的生长速度、肉质品质、疾病抗性等。本文将从CRISPR-Cas9技术在畜禽改良方面的应用现状及未来发展方向进行阐述。 展开更多
关键词 crispr-cas9 畜禽改良 基因编辑 生长速度 肉质品质 疾病抗性
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CRISPR-Cas9 mediated phage therapy as an alternative to antibiotics
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作者 Fikre Birhanu Balcha Sultan Abda Neja 《Animal Diseases》 CAS 2023年第4期231-241,共11页
Inappropriate use of antibiotics is globally creating public health hazards associated with antibiotic resistance.Bacteria often acquire antibiotic resistance by altering their genes through mutation or acquisition of... Inappropriate use of antibiotics is globally creating public health hazards associated with antibiotic resistance.Bacteria often acquire antibiotic resistance by altering their genes through mutation or acquisition of plasmid-encoding resistance genes.To treat drug-resistant strains of bacteria,the recently developed CRISPR-Cas9 system might be an alternative molecular tool to conventional antibiotics.It disables antibiotic-resistance genes(plasmids)or deactivates bacterial virulence factors and sensitizes drug-resistant bacteria through site-specific cleavage of crucial domains of their genome.This molecular tool uses phages as vehicles for CRISPR-cas9 delivery into bacteria.Since phages are species-specific and natural predators of bacteria,they are capable of easily injecting their DNA to target bacteria.The CRISPR system is packaged into phagemid vectors,in such a way that the bacteria containing the antibiotic-resistance plasmid sequence or that containing specific DNA sequences were made to be targeted.Upon CRISPR delivery,Cas9 is programmed to recognize target sequences through the guide RNA thereby causing double-strand cleavage of targeted bacterial DNA or loss of drug resistance plasmid,which results in cell death.Remarkably,the safety and efficacy of this newly developed biotechnology tool and the biocontrol product need to be further refined for its usage in clinical translation. 展开更多
关键词 crispr-cas9 BACTERIOPHAGE Phagemid Antibiotic-resistant
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