CRISPR-Cas9功能基因筛选技术在肝癌研究中的应用

肝癌是全球第四大致死肿瘤,对人类健康构成重大威胁。进展期肝癌缺乏有效靶点,以及目前标准疗法治疗效果有待进一步提高,是肝癌研究领域亟待解决的关键科学问题之一。CRISPR-Cas9功能基因筛选技术促进了肝癌生物学研究的发展,借助该技术,研究者发现了诸多参与肿瘤发生发展的靶基因。此外,无偏倚的CRISPR-Cas9功能基因筛选为探索耐药驱动机制和确定潜在治疗新靶点提供了基础。该文将系统阐述CRISPR-Cas9高通量功能基因筛选技术在肝癌研究领域取得的进展和突破,这些研究将有助于加深人们对肝癌的理解及开辟新的潜在治疗方案。

CRISPR-Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展

耐药是使用肿瘤分子靶向药物治疗肿瘤面临的主要问题,目前筛选耐药基因常用策略主要为功能性基因筛选。近年来,CRISPR-Cas9基因编辑技术因具有精准、简便、高效的特点,在肿瘤相关基因的功能学研究中被广泛应用。本文就CRISPR-Cas9文库筛选技术的原理和在功能性基因筛选方面的应用进行了综述,同时对该技术的应用前景进行了展望。

基于小分子化学反应工具构建CRISPR-Cas9功能调控体系的研究进展

CRISPR技术是目前基因编辑领域的一大研究热点,已在疾病治疗、作物改良等领域得到广泛的应用,CRISPR-Cas9系统是其中研究最为深入的一种类型.如何降低Cas9/sgRNA复合物在细胞内作用的脱靶性是CRISPR-Cas9技术发展面临的主要挑战之一.利用光或活性小分子诱发的小分子化学反应工具构建CRISPRCas9功能调控体系,通过对sgRNA,Cas9或Cas9/sgRNA复合物的功能进行调控,可以在细胞乃至活体水平上一定程度实现对CRISPR-Cas9作用的时间或空间特异性的操纵,大大降低非特异性基因编辑作用发生的概率,同时小分子对原体系的干扰较小,因此小分子化学反应逐渐成为操纵CRISPR-Cas9体系的一种重要的研究工具.本文总结和介绍了小分子反应工具用于CRISPR-Cas9功能调控系统构建的主要研究进展,并对其未来的发展进行了展望.

基于CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选功能基因及调控元件研究进展

CRISPR/Cas9系统是一种近年来被广泛应用于基因组编辑的强大工具。通过将CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白突变后,使其失去剪切活性而成为dCas9(nuclease-dead Cas9),再结合基因功能丧失(loss-of-function,LOF)、基因功能激活(gain-of-function,GOF)以及非编码功能基因鉴定技术即可实现全基因组高通量的功能基因及调控元件靶向鉴定和筛选。目前,该技术已被广泛应用于疾病免疫机理、药物靶点筛选和动物遗传育种等研究,为生命医学和基础科学带来了全新高效的技术方法和研究思路。本文综述了基于CRISPR/Cas9技术在全基因组中高通量筛选功能基因及调控元件的方法及研究进展,重点阐述了CRISPR/Cas9系统在动物细胞中筛选功能性基因的方法,以期为基因编辑及相关研究领域提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的研究进展

CRISPR-Cas9基因编辑技术具有简单、高效、针对性强的特点,可通过编辑DNA序列治疗一些难治的具有遗传基础的疾病,特别是癌症。近年来,此技术主要用于遗传修饰动物模型的制备与药物开发,现已进入癌症临床试验阶段,并获得喜人的成效,极具临床价值。本文对CRISPR-Cas9系统在肿瘤治疗中的研究进展,包括功能基因筛选、递送系统和免疫疗法等方面进行概述,探讨了其在临床转化中所面临的问题,并展望了发展前景,旨在为今后应用该技术进行肿瘤精准治疗提供参考。

基于CRISPR-Cas9的筛选文库的类型与应用

文库筛选技术广泛应用于生命科学研究各领域,加速了生物医药基础科研和临床实践的进展。本文对基于CRISPR-Cas9的文库类型和应用进行综述。CRISPR-Cas9文库包括敲除、活化和抑制文库。敲除文库通过Cas9/sgRNA靶向切割DNA序列,产生移码突变进行基因敲除。活化文库包括两种:一种是dCas9/sgRNA与转录活化蛋白质融合,例如dCas9-SAM,dCas9-SunTag和dCas9-VPR系统;另一种是dCas9与表观遗传修饰酶融合,例如d Cas9-Tet1和d Cas9-p300系统。CRISPR-Cas9抑制文库通过dCas9与表观遗传修饰蛋白质融合,抑制转录,例如d Cas9-KRAB和d Cas9-Dnmt3a系统。目前,CRISPR-Cas9文库广泛用于功能基因筛选、药物靶点和耐药靶点筛选、病毒靶点筛选和揭示信号通路,并在基因互作筛选及揭示顺式调节元件功能等方面初步展现其优势。CRISPR-Cas9文库优势在于其设计灵活、操作便捷、筛选高效。伴随基因编辑系统的研发,新的筛选文库靶向性和突变将更加精准,应用将更加拓展和深化。基于CRISPR-Cas9筛选文库不仅可以筛选病理和生理过程中的关键基因和非编码DNA,还可以揭示其发挥功能的分子机制,是剖析生命复杂调控网络的手术刀。

基因组编辑系统CRISPR-Cas9研究进展及其在猪研究中的应用

规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)及其相关的蛋白(Cas)原本是细菌抵御病毒的获得免疫系统,人们很快发现其应用潜力,即RNA引导的核酸酶Cas9对靶DNA进行基因组编辑:敲除、敲入、敲降。CRISPR-Cas9是继ZNF、TALENS技术之后的第三代基因组编辑技术,具有突变效率高、成本低、制作简单、能够诱导多位点同时突变等特点。除了基因工程功能外,CRISPR-Cas9系统还具有基因调控、基因组标记功能、大片段删除、全基因组扫描与编辑RNA等,且发展到CRISPR3.0,并继续开发其新应用。从2012年底开始,CRISPR的一系列创新性应用开启了整个基因组编辑研究的革命,成为生命科学领域的技术明星。文章对其最新进展进行了综述,并对其在猪中的应用及潜力进行了展望。

CRISPR-Cas9技术在医药领域中的应用

CRISPR-Cas9是存在于细菌和古细菌中的一种抵御噬菌体或质粒侵染的获得性免疫防御系统,它由成簇规律间隔短回文重复基因序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和Cas(CRISPR-associated)蛋白组成。天然的II型CRISPR系统已经被改造成第三代基因编辑工具,将单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)和作为DNA内切酶的Cas9蛋白导入细胞内,即可在基因组特定位置上进行基因编辑。由于CRISPR-Cas9具有简便高效、脱靶效应低等特点,目前已被广泛应用在动物、植物、微生物的生理和病理研究以及药物研发等领域。本文着重讲述了CRISPR-Cas9的作用机制以及它在医药领域中的应用,包括构建生物模型、疾病治疗、药物靶点筛选和CRISPR与免疫疗法的联合应用。

功能基因组学在环境化学品毒性机制研究中的应用

认识化学品的毒性机制是开展化学品健康风险评估的基础。掌握化学品有害效应的遗传易感性机制是开展精准的健康风险评估的前提。传统的毒理基因组学主要分析化学品暴露诱导的组学表达图谱,不能建立生物学表型与特定基因/通路表达的直接关联。功能基因组学通过敲除或者敲降全基因组或者特定的基因集,建立基因-化学品毒性的直接关联,进而研究化学品致毒的过程和机制,同时可以提供与化学品暴露的遗传易感性相关的分子响应信息。本论文综述了功能基因组学技术的原理及其主要发展,介绍了酵母、鸡DT40细胞和RNA干扰等功能基因组学测试方法的优缺点。同时,详述了CRISPR功能基因组学的原理和特点,以及其在化学品毒性机制研究中的应用,展望了联合应用分子流行病学和CRISPR功能基因组学,开展化学品有害效应的易感性机制研究。

基于CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展

功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法,在生物、医药、新治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)技术作为近期热门的基因编辑工具,能够高通量地对基因组进行精准修饰,为实现功能性基因的筛选提供了简便高效的技术支持。文中对CRISPR-cas9技术应用于功能性基因筛选的方法及研究进展进行了综述。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在基因功能和作物育种中的研究进展

基因编辑技术是研究基因功能和作物改良品种的有力工具。该技术依靠工程内切酶在目标位点产生双链断裂(double strand DNA breaks, DSB)。随后双链断裂通过非同源末端连接(non-homologous end-joining,NEHJ)和同源重组(homology-directed repair, HDR)两种途径修复,分别导致突变和序列替换。目前应用最广泛的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统,它主要由Cas9蛋白和单链RNA组成,在RNA的引导下对目标基因进行编辑。本综述简要介绍基因编辑技术的发展,侧重于CRISPR-Cas9系统的发展以及其在基因功能和作物育种中的最新研究进展。

新孢子虫天冬氨酰蛋白酶ASP5功能研究

目的制备抗新孢子虫NcASP5多克隆抗体,对NcASP5蛋白进行亚细胞定位;构建NcASP5基因敲除虫株(△NcASP5),探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。方法原核表达NcASP5蛋白,纯化后免疫小鼠,制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcASP5蛋白亚细胞定位;运用CRISPR-cas9技术构建△NcASP5虫株,通过噬斑试验、入侵试验、增殖试验、逸出试验和动物试验探究NcASP5蛋白在虫体入侵、生长及致病中的作用。结果成功制备抗NcASP5蛋白多克隆抗体,免疫荧光法观察NcASP5蛋白定位于虫体细胞质;成功构建△NcASP5虫株,其噬斑面积、入侵率和逸出率与野生虫株比较差异均无统计学意义(均P>0.05),增殖率△NcASP5虫株在含1个与8个速殖子的纳虫空泡的数量所占百分比差异有统计学意义(P<0.05)。与感染野生虫株小鼠相比,感染△NcASP5虫株小鼠死亡时间延长2~4 d,组织中荷虫量差异无统计学意义(P>0.05)。结论敲除NcASP5基因对新孢子虫虫体增殖有显著影响,而对虫体的生长、入侵及毒力等无显著影响,这为揭示新孢子虫致病机制和新孢子虫病防控提供了理论依据。

孤雄单倍体胚胎干细胞的建立及其应用

小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞携带一套来源于精子的遗传物质,与二倍体胚胎干细胞相似,拥有干细胞的自我更新和多向分化等特性,能够在体外长期稳定地培养。重要的是,该细胞能够代替精子在注入到卵母细胞中后,产生半克隆小鼠。因其兼具干细胞和精子特性,故又被称为“人造精子”细胞或者类精子干细胞。将孤雄单倍体胚胎干细胞与CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)等新型基因编辑技术结合起来,能够在细胞水平和动物个体水平进行精准、复杂和高通量的遗传改造,为基因的功能研究提供了强有力的工具。本文综述了孤雄单倍体胚胎干细胞的建立,及其在印记基因功能研究、遗传筛选、人类疾病模拟和蛋白质标签打靶等方面的应用。