利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展

近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)系统在内的基因编辑工具使生物体的基因组DNA靶向修饰成为可能,尤其是CRISPR-Cas9系统的出现,加速了基因编辑技术的发展,成为基础科学和应用科学中的革命性工具。与ZFNs和TALENs技术相比,CRISPR-Cas9系统因其高灵活性、灵敏度、特异性和成本效益而被广泛使用。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过靶向特定序列精确地切割DNA,并通过在特定基因组位点产生双链断裂来添加、去除或替换核苷酸等方式在位点引入特异性修饰对畜牧生产的不同方面做出了重大贡献,产生了改善牲畜生产和具有抗病性等多种动物模型,以研究畜禽关键基因功能,加速性状改良。作者主要阐述了CRISPR-Cas9系统的机制与功能及其在牛、羊生产中的应用进展,以期为今后的相关研究提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作

CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在特种药材中的研究与应用

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALEN核酸酶(TALENs)之后、可高效定点编辑的第三代基因编辑技术,是目前基因功能研究和遗传疾病治疗等生命科学领域最前沿的基因编辑技术,在植物现代生物技术中占据着很重要的地位,特别是在作物遗传改良方面。作为作物遗传改良育种的有效技术手段,CRISPR-Cas9基因编辑技术为创制特种药材新种质资源特别是专用型品种资源带来了新契机,对于特种药材种质创新具有极其重要的作用。本文对CRISPR-Cas9基因编辑技术在特种药材中的研究与应用进行了综述,以期为特种药材的基因功能研究以及种质创新工作提供良好的研究基础与理论依据。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

CRISPR-Cas9基因编辑的历史

基因编辑是指在细胞内对遗传物质进行修改,是目前应用非常广泛的一种创制变异的技术手段。目前常用的基因编辑体系主要是CRISPR/Cas9系统。从间隔重复回文序列的发现,到重复序列的追根溯源及功能解析,再到CRISPR/Cas9系统在细菌、动物及植物中基因编辑功能的实现,在短短几年内,CRISPR-Cas9基因编辑技术迅猛发展,深刻改变了生命科学研究。

基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的茶叶育种研究

为解决传统茶叶育种成活率低的问题,基于CRISPR-Cas9基因编辑技术设计茶叶育种方法。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除茶叶育种致死基因;将sgRNA:pcoCas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗,敲入茶叶育种优质基因;利用非末端同源连接,实现茶叶育种。设计实例分析,结果表明,设计方法茶叶育种成活率明显高于对照组,能够解决传统茶叶育种成活率低的问题。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎

为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证后所得的体外切割活性最高的gRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射牛的受精卵,培养至囊胚后,利用T7EI核酸内切酶法检测囊胚中MSTN基因的编辑情况,然后将基因编辑阳性的囊胚样品进行测序验证。结果表明,牛胚胎体外培养平均囊胚率为21.28%;在设计的多条gRNA序列中,gRNA5的体外切割活性最高,为96.00%;将Cas9 mRNA和gRNA5的混合物显微注射受精卵并培养至囊胚后,T7EI核酸内切酶检测表明囊胚MSTN基因切割阳性率为15.40%;对MSTN基因编辑囊胚阳性样品测序表明,在gRNA5靶位点存在部分片段缺失。综上,说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功获得了牛MSTN基因编辑胚胎。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在念珠菌中的应用研究进展

近年来,真菌感染已经成为严重威胁全球健康的疾病,全球约有3亿人遭受了侵袭性真菌感染,造成每年约有160万人死亡,接近结核病的死亡人数[1]。尤其随着免疫功能低下人群的不断增加,侵袭性真菌感染导致的死亡率高达30%~90%[2]。念珠菌属是真菌感染的主要致病菌,白念珠菌仍然是最常见的菌种,而非白念珠菌侵袭性感染所占的比例明显升高[3-4]。

诺贝尔化学奖授予CRISPR-Cas9基因编辑研究

2020年,诺贝尔化学奖授予现就职于德国马普感染生物学研究所的法籍科学家Emmanuelle Charpentier和美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna,表彰她们发明CRISPR基因编辑方法.她们揭示了Cas9具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性,可以切断任意DNA双链,产生双链断裂.她们指出CRISPR具有在活细胞中修改基因的作用,利用CRISPR-Cas9编辑工具,可以精确改变细胞中的DNA.由于简单、高效、廉价等特征,CRISPR已经成为最为流行的基因编辑技术,被称为基因编辑"魔剪".本文介绍了两位诺贝尔化学奖得主的研究成果,概述了CRISPR系统的发现历程,以及CRISPR-Cas9的功能和应用.

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的研究进展

CRISPR-Cas9基因编辑技术具有简单、高效、针对性强的特点,可通过编辑DNA序列治疗一些难治的具有遗传基础的疾病,特别是癌症。近年来,此技术主要用于遗传修饰动物模型的制备与药物开发,现已进入癌症临床试验阶段,并获得喜人的成效,极具临床价值。本文对CRISPR-Cas9系统在肿瘤治疗中的研究进展,包括功能基因筛选、递送系统和免疫疗法等方面进行概述,探讨了其在临床转化中所面临的问题,并展望了发展前景,旨在为今后应用该技术进行肿瘤精准治疗提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在眼科疾病中的应用

规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及相关核酸内切酶9(CRISPR associated protein,Cas9)技术是一种由RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术。该技术以其操作简便、基因敲除效率高、靶向精准、周期短等特点迅速被用于多个物种的基因组编辑及疾病基因治疗中。本文旨在对CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型和治疗眼科疾病中的应用进展进行综述。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的应用进展

CRISPR-Cas9是一种以细菌和古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的新型基因编辑技术。与传统的锌指核酸酶(ZFN)、胚胎干细胞(ES细胞)打靶和转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比,该基因编辑技术具有操作简单、更加高效、更容易获得纯合子突变体、细胞毒性小、无物种限制等优势,但也存在脱靶效应等缺点。目前,CRISPR-Cas9技术已被广泛用于肿瘤相关研究中,尤其在构建实验动物肿瘤模型中取得许多重要成果。我们主要对CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肝癌模型、结直肠癌模型、肺癌模型、宫颈癌模型、白血病模型、脑瘤模型中的研究现状及应用进展做简要综述。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤基因治疗中的研究进展

规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISPR相关酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统是古细菌和细菌在与噬菌体抗争的进化过程中产生的抵御外源DNA入侵的一种适应性免疫机制,能有效识别并切割外源DNA.CRISPR-Cas9系统被开发成为新一代的基因编辑技术,相较于传统的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)打靶技术,该技术操作简单,效率高,成本低,有着极其广阔的应用前景.目前,CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用到恶性肿瘤的相关研究中.整理了近几年来有关CRISPR-Cas9基因编辑技术在恶性肿瘤基因治疗中的最新文献报道,并对其研究现状及进展作一综述.

优化的CRISPR-Cas9基因编辑有望治疗镰状细胞病

在一项新的研究中,来自美国达纳法伯癌症研究所、波士顿儿童医院和马萨诸塞大学医学院等研究机构的研究人员通过将CRISPRCas9基因编辑应用于患者自己的造血干细胞中,开发出一种治疗一种最为常见的遗传性血液疾病——镰状细胞病(sickle cell disease)——的策略。这种方法克服了之前的技术挑战.

CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙肝病毒感染治疗中的应用

目的探讨CRISPR-Cas9基因编辑技术在乙肝病毒感染治疗中的应用。方法构建CBFβ表达载体,根据从Hep G2细胞中提取的RNA,反转得到c DNA,设计CBFβ引物扩增目的基因,连接,转化,挑取阳性克隆,通过PCR鉴定及酶切鉴定,测序进一步鉴定。结果获得了稳定敲除CBFβ的Hep G2细胞系及稳定表达的CBFβ真核表达载体。结论 CRISPR-Cas9技术可有效清除感染细胞内基因组,对于乙肝的治疗意义重大,值得推广。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤治疗中的应用和不足

RNA引导的CRISPR-Cas9核酸酶系统最初作为适应性免疫系统的一部分在细菌和古细菌中被发现。CRISPR-Cas9在癌症免疫治疗、操纵癌基因组和表观基因组、消除或灭活致癌病毒等方面显示出巨大的癌症治疗前景。尽管其具有明显的优势和巨大的潜力,未来要实现临床应用,仍然有诸多挑战待解决,如:编辑细胞的适合性、编辑效率、递送方法和潜在的脱靶效应等。本文将介绍CRISPR - Cas9在肿瘤治疗中的潜在应用,并讨论CRISPR - Cas9在临床治疗中中可能遇到的挑战。

木薯MeMLO12基因克隆及其CRISPR-Cas9表达载体的构建

MLO基因是植物中特有的一类抗病性负调控因子,该基因突变导致植物产生广谱抗病性。本研究从木薯全基因组中克隆获得木薯MLO12基因的DNA和cDNA序列,并将其命名为MeMLO12。该基因全长3743 nt、编码区(ORF)全长1728 nt,具有一个完整的开放阅读框,含有15个外显子和14个内含子,编码586个氨基酸,蛋白的分子质量为67.2 kDa,等电点为8.85。该基因编码的蛋白定位在内质网膜上,无信号肽,在23~45、74~96、161~183、285~307、312~334、371~393、413~435 aa处形成7次跨膜结构域。qRT-PCR定量分析发现,受木薯黄单胞病菌侵染后,MeMLO12基因在木薯抗、感品种中的表达量存在明显的差异,参与木薯与黄单胞菌之间的互作,表现出负调控作用。选择该基因第11个外显子进行Snap Gene Viewer分析,获得了10 455条sgRNA的种子序列,从中选取3条靶序列约23 nt,碱基组成上3'末端含G结尾,将其构建到CRISPR-Cas9载体上,经验证,确认MeMLO12的3条靶序列已经成功构建到基因编辑载体上,将其命名为pSGR-Cas9-AT-MeMLO12载体。

CRISPR-Cas基因编辑技术在羊生产应用中研究进展

基因编辑是一种能够进行基因组修饰的基因工程技术。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)作为新发展起来的一种强大的基因编辑工具,因具有高效性、精确性和灵活性而被广泛应用。CRISPR-Cas系统通过在特定基因组位点引入插入、缺失或单碱基替换等方式实现位点的特异性修饰,在畜牧生产的诸多领域做出了重大贡献。在羊生产应用方面,通过建立改善生产经济性状和抗病性的绵山羊动物模型,可以对关键基因的功能进行研究,从而加速性状的改良。本文主要综述了CRISPR-Cas系统的机制与功能及其在羊繁殖性状、肉用性状、产毛性状、泌乳性状和抗病性状生产应用与创建羊动物模型方面的研究进展。

小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化

小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。