CRISPR-Cas9基因编辑技术在牛、羊生产中的应用研究进展

近年来,基因编辑技术作为一种基因组修饰工具迅速发展,包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)和成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)系统在内的基因编辑工具使生物体的基因组DNA靶向修饰成为可能,尤其是CRISPR-Cas9系统的出现,加速了基因编辑技术的发展,成为基础科学和应用科学中的革命性工具。与ZFNs和TALENs技术相比,CRISPR-Cas9系统因其高灵活性、灵敏度、特异性和成本效益而被广泛使用。CRISPR-Cas9基因编辑技术通过靶向特定序列精确地切割DNA,并通过在特定基因组位点产生双链断裂来添加、去除或替换核苷酸等方式在位点引入特异性修饰对畜牧生产的不同方面做出了重大贡献,产生了改善牲畜生产和具有抗病性等多种动物模型,以研究畜禽关键基因功能,加速性状改良。作者主要阐述了CRISPR-Cas9系统的机制与功能及其在牛、羊生产中的应用进展,以期为今后的相关研究提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术对细胞内源蛋白进行荧光标记的实验操作

CRISPR-Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,可对目的基因进行高效精准编辑,快速实现目的基因的敲除或敲入。Cas9蛋白在sgRNA引导下对靶序列进行剪切并造成DNA双链断裂,在与剪切位点两端同源的DNA模板序列存在时,可通过同源重组修复方式引入外源序列,实现荧光蛋白或其他标签在基因组上的精准敲入,进而实现对内源蛋白进行荧光标签的融合标记。通过基因编辑技术对内源目的蛋白进行标记,可避免由于过表达造成蛋白质定位、动力学或功能等的潜在影响,可显著提升细胞成像实验的稳定性和可重复性。本文重点介绍了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统对目的蛋白进行荧光蛋白或自标记蛋白标签标记的方法与操作流程,为构建内源蛋白荧光标记的哺乳动物细胞系提供参考。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在特种药材中的研究与应用

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶(ZFNs)和TALEN核酸酶(TALENs)之后、可高效定点编辑的第三代基因编辑技术,是目前基因功能研究和遗传疾病治疗等生命科学领域最前沿的基因编辑技术,在植物现代生物技术中占据着很重要的地位,特别是在作物遗传改良方面。作为作物遗传改良育种的有效技术手段,CRISPR-Cas9基因编辑技术为创制特种药材新种质资源特别是专用型品种资源带来了新契机,对于特种药材种质创新具有极其重要的作用。本文对CRISPR-Cas9基因编辑技术在特种药材中的研究与应用进行了综述,以期为特种药材的基因功能研究以及种质创新工作提供良好的研究基础与理论依据。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制

基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。

基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的茶叶育种研究

为解决传统茶叶育种成活率低的问题,基于CRISPR-Cas9基因编辑技术设计茶叶育种方法。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除茶叶育种致死基因;将sgRNA:pcoCas9茶叶育种优质基因导入茶叶树苗,敲入茶叶育种优质基因;利用非末端同源连接,实现茶叶育种。设计实例分析,结果表明,设计方法茶叶育种成活率明显高于对照组,能够解决传统茶叶育种成活率低的问题。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎

为了给双肌肉牛品种的培育提供新的遗传素材,拟利用CRISPR-Cas9基因编辑技术制备牛MSTN基因编辑胚胎。从采集到的86对牛卵巢中收集卵母细胞进行成熟培养以及体外受精,并使用在线软件设计能够在体外高效编辑牛MSTN基因的gRNA序列,将验证后所得的体外切割活性最高的gRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射牛的受精卵,培养至囊胚后,利用T7EI核酸内切酶法检测囊胚中MSTN基因的编辑情况,然后将基因编辑阳性的囊胚样品进行测序验证。结果表明,牛胚胎体外培养平均囊胚率为21.28%;在设计的多条gRNA序列中,gRNA5的体外切割活性最高,为96.00%;将Cas9 mRNA和gRNA5的混合物显微注射受精卵并培养至囊胚后,T7EI核酸内切酶检测表明囊胚MSTN基因切割阳性率为15.40%;对MSTN基因编辑囊胚阳性样品测序表明,在gRNA5靶位点存在部分片段缺失。综上,说明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功获得了牛MSTN基因编辑胚胎。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在念珠菌中的应用研究进展

近年来,真菌感染已经成为严重威胁全球健康的疾病,全球约有3亿人遭受了侵袭性真菌感染,造成每年约有160万人死亡,接近结核病的死亡人数[1]。尤其随着免疫功能低下人群的不断增加,侵袭性真菌感染导致的死亡率高达30%~90%[2]。念珠菌属是真菌感染的主要致病菌,白念珠菌仍然是最常见的菌种,而非白念珠菌侵袭性感染所占的比例明显升高[3-4]。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在眼科疾病中的应用

规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及相关核酸内切酶9(CRISPR associated protein,Cas9)技术是一种由RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术。该技术以其操作简便、基因敲除效率高、靶向精准、周期短等特点迅速被用于多个物种的基因组编辑及疾病基因治疗中。本文旨在对CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型和治疗眼科疾病中的应用进展进行综述。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤基因治疗中的研究进展

规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISPR相关酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统是古细菌和细菌在与噬菌体抗争的进化过程中产生的抵御外源DNA入侵的一种适应性免疫机制,能有效识别并切割外源DNA.CRISPR-Cas9系统被开发成为新一代的基因编辑技术,相较于传统的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)打靶技术,该技术操作简单,效率高,成本低,有着极其广阔的应用前景.目前,CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用到恶性肿瘤的相关研究中.整理了近几年来有关CRISPR-Cas9基因编辑技术在恶性肿瘤基因治疗中的最新文献报道,并对其研究现状及进展作一综述.

CRISPR-Cas基因编辑技术在羊生产应用中研究进展

基因编辑是一种能够进行基因组修饰的基因工程技术。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,成簇规则间隔短回文重复序列相关蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein,CRISPR-Cas)作为新发展起来的一种强大的基因编辑工具,因具有高效性、精确性和灵活性而被广泛应用。CRISPR-Cas系统通过在特定基因组位点引入插入、缺失或单碱基替换等方式实现位点的特异性修饰,在畜牧生产的诸多领域做出了重大贡献。在羊生产应用方面,通过建立改善生产经济性状和抗病性的绵山羊动物模型,可以对关键基因的功能进行研究,从而加速性状的改良。本文主要综述了CRISPR-Cas系统的机制与功能及其在羊繁殖性状、肉用性状、产毛性状、泌乳性状和抗病性状生产应用与创建羊动物模型方面的研究进展。

基于CRISPR-Cas9基因编辑技术在作物中的应用

CRISPR-Cas9系统是由成规律的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)及其相关蛋白构成,广泛存在于细菌和古细菌中,该系统作为一种特异性免疫保护,可抵御病毒、噬菌体的二次侵染。CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases,TALENs)技术之后的第三代新型靶向基因组编辑技术。CRISPR-Cas9技术具有灵活、高效、生产成本低且特异性高等优点,极大地促进了基因功能方面的研究。CRISPR-Cas9技术经过不断的完善和发展,目前该技术已广泛应用在各个领域。本文介绍了CRISPR-Cas9技术的产生、工作机制及优势;综述了CRISPR-Cas9技术在基因敲除、基因敲入、基因调控和基因组方面的应用以及在水稻、小麦、玉米、大豆和马铃薯等重要粮食作物以及对作物驯化的应用;分析了CRISPR-Cas9技术目前面临的问题和挑战,并展望了CRISPR-Cas9技术的发展及应用前景。

利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T0代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T1代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T2代植株表型性状、稻米蒸煮食味品质和外观品质指标进行了考察和测定分析。结果表明,所有指标在两组材料间均无显著差异。进一步采用测交和回交转育方法并结合Badh2位点测序分析,成功选育获得了其对应的纯合香型三系不育系明太A-badh2。通过与恢复系明恢703、明恢3009测配,其组合产量与国家审定品种明太优703、明太优3009相近且表现出较强的超标优势。此外,通过与香型恢复系明恢1831测配后发现其组合籽粒中香味物质2-AP含量极显著高于对照组合明太A/明恢1831。因此,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,可对水稻香味基因Badh2进行精准定向编辑和敲除,实现对水稻香味性状的改良,为创制香型籼稻不育系提供理论指导,从而加快香型杂交稻育种进程。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用研究进展

基因编辑技术是一种对目的基因进行特定修饰的技术,被广泛应用于生物育种、疾病模型构建等研究领域。CRISPR/Cas9系统由重复和间隔单元组成的CRISPR阵列和一个Cas基因座位组成,能够对生物体性状进行目的基因定点编辑,具有简单、精确且高效的特点。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过引入基因敲除、基因敲入、缺失、点突变和单核苷酸突变等不同形式的修饰广泛应用于畜禽的基因编辑,以研究畜禽关键基因功能,从而加速性状改良。相较于猪、鸡等其他畜禽,CRISPR/Cas9技术对羊的研究相对滞后。文章重点阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用,对其在产肉性状、纤维性状、泌乳性状和人类疾病模型等方面的应用研究进展及前景进行了简要概述,以期为我国羊产业的可持续发展提供参考。

基因编辑技术CRISPR-Cas9在畜禽改良领域的应用

基因编辑技术是一种新兴的基因改良方法,其可以精准地修改生物体的基因序列,从而改变生物体性状。在畜禽改良领域,CRISPR-Cas9技术可以被用来改良畜禽的生长速度、肉质品质、疾病抗性等。本文将从CRISPR-Cas9技术在畜禽改良方面的应用现状及未来发展方向进行阐述。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物抗病性改良中的应用综述

植物病害是影响作物生长的重要因素之一,对世界粮食安全构成很大的威胁,培育优良的抗病品种成为最优策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术自问世以来备受关注,因该系统简单、高效、稳定的特点,逐渐成为分子育种领域重要的技术手段。本综述简单回顾了CRISPR/Cas9基因编辑技术的技术原理和在植物中的应用情况,系统总结了该技术在植物抗真菌、细菌和病毒方面的应用。还列举了可用于提高植物抗病性的基因位点以及真菌、细菌和病毒等病原物的致病相关基因位点编辑应用情况,探讨了该技术主要的优势和不足,以及未来应用的前景和挑战,以期为今后研究提供参考和借鉴。

比较CRISPR/Cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响

为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定CRISPR/Cas9和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和HiTOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化。结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2和PE3b的编辑效率分别为20.420%、36.735%和40.180%;PE3b较PE2编辑效率提升3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到83个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到144个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到85个(36.32%)。本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,CRISPR/Cas9编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在精准肿瘤学研究中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术通过精准定位和修改基因序列,可以识别与细胞增殖、迁移、侵袭和化疗耐药性相关的基因,不仅为理解肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础,还为实现肿瘤的精准治疗提供了一种方便、高效的方法。由于其具有低成本、高效率的优点,被广泛地应用于精准肿瘤学的基础和临床研究当中,包括用于探寻抗肿瘤药物耐药靶点、筛查驱动基因、优化CAR-T和TCR-T细胞,以及筛选肿瘤靶向基因等。目前,已开展了十余项项使用CRISPR/Cas9技术治疗肿瘤的临床试验,策略多为利用CRISPR/Cas9技术敲除T细胞中的免疫检查点基因后回输患者,以达到免疫激活的效果,大多数研究仍处于Ⅰ期和Ⅱ期阶段。尽管CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究与治疗领域展现出了巨大潜力,但仍需面对脱靶效应,以及永久编辑可能带来的弊端等瓶颈,其实际临床效用仍有待更多的深入研究和大规模临床试验的严格验证。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统在crRNA的指导下,使核酸酶Cas识别并降解外源DNA。其中,Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单,仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA:crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA设计为引导RNA,在引导RNA的指导下Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。CRISPR-Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术,为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命。从CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。

CRISPR-Cas基因编辑技术在微生物组工程中的应用

微生物组工程是对复杂微生物群落进行改造,在基因组、代谢组及群落生态结构等多个层次上实现微生物组的精准调控.成簇规律间隔短回文序列(CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统是近期发展迅速的高效基因编辑工具.本文回顾了微生物组工程领域CRISPR-Cas系统的重要研究工作,重点关注CRISPR-Cas系统在微生物组的基因编辑和生态调控方面的应用.针对CRISPR-Cas系统在微生物组工程领域的应用挑战,本文从外源DNA递送方式和基因表达调控元件两个方面总结了微生物组工程的关键辅助方法与发展趋势,展望了微生物组工程领域所面临的挑战与机遇.

基因编辑技术在鱼类遗传育种中的应用

基因编辑(Gene Editing)是一种能够对生物进行基因定向编辑或修饰的生物技术。近年来,随着全基因测序技术的改革和基因编辑技术的系统优化,使得基因编辑成为生命科学领域最广泛应用的技术之一。目前基因编辑技术已应用于多种鱼类的基因组靶向改造。本文综述了基因编辑技术的发展历程、作用原理和该技术在鱼类遗传育种中的应用,为其在鱼类基因功能解析、经济性状调控机制解析和遗传改良研究提供参考。