CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在草类植物中的应用

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为相关领域的研究工作奠定了基础。

用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sg KLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响。方法设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体p X459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性。将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力。结果经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒p X459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强。结论成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性。

基于CRISPR/Cas9技术快速构建PRV gE基因缺失病毒

为快速、高效构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白E基因(gE)缺失病毒,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先将pSpCas9(BB)-2A-GFP荧光质粒转染至VERO细胞和PK-15细胞,选出转染效率较高的细胞系,同时于http://crispr.mit.edu/网站设计并合成3个高评分的小导向RNA(small guide RNA,sgRNA),通过噬斑形成试验,筛选出高效sgRNA。其次将筛选出的针对PRV gE基因的sgRNA转染于PK-15细胞,然后接种PRV-1病毒,经过5轮噬斑克隆纯化获得PRV-1-ΔgE。结果显示:VERO细胞比PK-15细胞具有更好的转染效果;gE-sgRNA1和gE-sgRNA2可作为针对gE基因的高效sgRNA;获得了1株PRV gE基因缺失291 bp的病毒,将其命名为PRV-1-ΔgE。研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为一种高效编辑PRV-1缺失病毒基因的方法,同时也为后续快速应对PRV变异株研究提供了新思路。

植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物的遗传转化以及不同抗生素筛选的要求,具有简便、高效,可同时对多基因进行编辑的特点.此外,为了能更高效地应用基因组编辑技术,还开发了一站式在线分析工具包CRISPR-GE.为方便研究人员利用CRISPR/Cas9系统进行植物基因组编辑,本文提供了从靶点选择、CRISPR/Cas9多靶点双元载体构建,以及对靶点突变序列的测序分析等详细的操作方法,以及常见的问题解答.

利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP^+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10^3.8TCID50和10^2.5TCID50,表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD50和10LD50强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。