利用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母的研究进展

酿酒酵母是常用的工业生产菌株,改造酿酒酵母以提高其生产性能极为重要。然而,传统的改造方法存在步骤繁琐、周期长等问题。CRISPR/Cas9系统是在细菌和古细菌发现的自适应防御系统。目前CRISPR/Cas9系统已经成为基因组编辑的有力工具,能够同时改造酿酒酵母的多个基因。本文综述CRISPR/Cas9系统各组分的作用和系统的构建,介绍sgRNA靶序列的设计原则和代表性设计工具,总结对酿酒酵母进行多基因编辑的策略,以及CRISPR/Cas9系统存在脱靶和编辑效率低的问题和应对展望,为更好地应用CRISPR/Cas9系统改造酿酒酵母提供参考。

CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力,快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而,CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题,例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序(PAM)对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等,严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展,阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制,“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的Ⅱ类CRISPR/Cas系统,重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制,及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展,同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述,例如CRISPR/CasФ和CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题,有力地拓展了其功能和适用性,势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。

基于小分子化学反应工具构建CRISPR-Cas9功能调控体系的研究进展

CRISPR技术是目前基因编辑领域的一大研究热点,已在疾病治疗、作物改良等领域得到广泛的应用,CRISPR-Cas9系统是其中研究最为深入的一种类型.如何降低Cas9/sgRNA复合物在细胞内作用的脱靶性是CRISPR-Cas9技术发展面临的主要挑战之一.利用光或活性小分子诱发的小分子化学反应工具构建CRISPRCas9功能调控体系,通过对sgRNA,Cas9或Cas9/sgRNA复合物的功能进行调控,可以在细胞乃至活体水平上一定程度实现对CRISPR-Cas9作用的时间或空间特异性的操纵,大大降低非特异性基因编辑作用发生的概率,同时小分子对原体系的干扰较小,因此小分子化学反应逐渐成为操纵CRISPR-Cas9体系的一种重要的研究工具.本文总结和介绍了小分子反应工具用于CRISPR-Cas9功能调控系统构建的主要研究进展,并对其未来的发展进行了展望.

CRISPR/Cas9系统技术难关:脱靶效应及其优化方法

近年来,基因编辑新技术CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)颇受关注,可用于在体内或体外编辑多种细胞中的单个或多个基因,为基因功能研究提供了新思路。Cas9核酸酶可以通过改变其引导的单一向导RNA(single-guideRNA,sgRNA)序列,结合到新的特定基因序列进行靶向编辑。研究发现,CRISPR/Cas9系统存在的脱靶风险已成为该技术实际应用过程中的一个挑战。本文对CRISPR/Cas9系统作用机制、肿瘤临床应用进行简要综述,重点关注该系统存在的脱靶效应,并总结归纳减少或避免脱靶的方法,以期为相关领域研究提供参考。

基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析

以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。

CRISPR/Cas9系统中的脱靶效应及检测技术研究进展

聚类规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(Cas9蛋白)已经成为精确编辑基因组的强大工具。CRISPR/Cas9系统源自于细菌和古生菌的免疫机制,结构简单、易于设计,仅需改变单引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)上的一小段序列即可快速实现对不同基因位点的编辑。与锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术相比,CRISPR/Cas9系统基因编辑效率更高、特异性更强。但在应用过程中不可避免的脱靶事件严重限制了CRISPR/Cas9系统的进一步发展,因此本篇文章就CRISPR/Cas9系统的脱靶类型、影响因素、降低策略以及脱靶检测技术进行综述。

非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战

建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。

CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统。目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具。自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长。农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物。本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景。

基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明,2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应

在细菌中发现的免疫系统CRISPR/Cas9,已经成为最有效的基因工程编辑工具,甚至大有希望可以治疗人类遗传性疾病。但是CRISPR/Cas9系统在使用时会产生严重的脱靶问题,导致假表型和错误的解释。提高与靶点结合的高效率,同时减少脱靶效应,将是今后CRISPR/Cas9技术的挑战。综述关注与CRISPR/Cas9脱靶效应相关的内容,总结了影响其靶点专一性的因素,减少CRISPR/Cas9脱靶效应的可行性方法和设计工具等,供大家学习讨论。

慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P<0.01)。Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P<0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P<0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。

CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略

近年,CRISPR/Cas9系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)之后的第三代人工改造的核酸内切酶,被喻为"基因魔剪".该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列,并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点,进而完成对靶基因的编辑.由于其设计简单、实施快捷、成本低廉,突变效率高等优点,这一系统在基因组功能鉴定、抗病毒、抗肿瘤、免疫治疗等众多领域已广泛研究.虽然CRISPR/Cas9系统具有如此多的优点,但是其可能存在的脱靶风险影响了该基因编辑技术的深入研究,增加了用于疾病治疗的风险,阻碍了临床的进一步应用.如何保证CRISPR/Cas9基因编辑技术高编辑效率,同时也能降低脱靶效应,这将是未来科学研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题.为此我们在文章中对CRISPR/Cas9系统组成、作用机制及应用进展进行简要综述,着重介绍目前这一领域广受关注的脱靶效应,并归纳优化策略,以期为更多的研究者提供参考.

新一代精准基因编辑工具CRISPR/Cas9的技术优势与应用局限

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)是继锌指核酸酶(ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)基因编辑技术之后的第三代基因编辑技术。CRISPR/Cas9在细菌和古生菌中广泛存在,是细菌在长期进化过程中形成的一种"适应性免疫防御",能够针对噬菌体感染、质粒接合和转化所造成的外源导入基因特异性识别、降解入侵的外源DNA,CRISPR/Cas9通过一段20 bp的短RNA来识别打靶位点的精准编辑技术。CRISPR/Cas9具有设计操作简便、编辑高效和通用性广等优点,是新一代具有革命意义的精准基因编辑技术。从CRISPR/Cas9的发现、作用机理、基因编辑以及应用局限等方面进行归纳总结,旨为理解其工作原理和精准基因编辑技术应用提供参考。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在病原微生物中的应用

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)广泛存在于古细菌及细菌中是细菌在长期进化过程中形成的一种获得性免疫系统。近年来以该系统为基础,经过人工改造形成的一种新型基因编辑技术—CRISPR/Cas9在基因工程领域的应用越发广泛;该技术与前两代编辑技术相比,具有结构简单、成本低廉、实用价值较高等优点。自2012年在基因研究领域成功应用后,已成为当前关注度较高的基因编辑工具;该技术在多种真核生物的基因修饰中已得到成功应用,但在病原微生物上却报道较少。本文将从CRISPR/Cas9系统的结构、作用机制及其在病原微生物基因功能研究中的应用等几个方面进行综述为其深入研究奠定基础。

CRISPR-Cas9技术在细菌中的研究进展及应用

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最早发现于绝大多数细菌和古细菌中,帮助其防御和抵抗噬菌体和外来质粒的入侵。近年来,随着对该系统结构及功能的逐步深入认识和研究,CRISPR-Cas9技术已经发展成为一种简易高效的基因组定点编辑手段,但是在使用过程中仍存在一些问题。本文重点介绍了CRISPR-Cas9系统功能和分类,在细菌基因编辑中的应用和问题以及应对措施。

CRISPR／Cas9基因组编辑技术及其影响因素

CRISPR/Cas9技术可对基因组进行定点修饰,近几年已被广泛用于细胞和生物体中,是目前最新、最高效的基因组编辑技术。本文主要介绍了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的原理、在动物基因组修饰中的应用以及该技术可能存在的问题,比如sg RNA的设计、ss ODNs模板的设计以及降低脱靶效应的研究,从而为提高CRISPR/Cas9基因组编辑效率奠定基础。

基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究

目的针对人源TCRαC基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率。方法利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRαC区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率。再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶。结果在3组针对TCRαC区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率最高,并且无脱靶现象。结论针对人源TCRαC基因设计的site2-gRNA对TCRαC区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础。