运用CRISPR-dCas9-VP64基因编辑技术验证microRNA-140的独立转录启动位点

目的探讨microRNA-140(miR-140)是否有独立于其宿主基因WWP2的转录启动子,从而为骨性关节炎的治疗提供新的思路。方法通过共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞验证软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。通过构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞并结合多条sgRNA(single guide RNA,sgRNA/gRNA)、人类髋关节软骨RNA测序结果验证miR-140是否与WWP2基因共表达,是否有独立的转录启动位点。结果共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞能显著提高软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。从基因水平、蛋白水平证实成功构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞。通过人类髋关节软骨RNA测序结果设计多条WWP2 gRNA以及miR-140启动子gRNA。实时定量PCR结果显示miR-140的表达既受其宿主基因WWP2调控,同时也有其独立的转录位点。结论运用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建稳定表达CRISPR-dCas9-VP64蛋白的SW1353细胞能极大减少实验中样本间的差异化,保证实验结果的一致性。结合多条gRNA证明了miR-140既与WWP2共表达,同时也受其独立的转录启动子调控转录。运用CRISPR-dCas9-VP64d-gRNA能单独调控miR-140的表达,同时其宿主基因的表达不受影响,有潜力作为新兴的基因治疗方法治疗骨性关节炎。