CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响

目的探讨CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响。方法采用免疫组化法检测CrkⅡ在108例喉癌患者喉癌组织及癌旁正常组织中的表达情况,分析不同临床特征喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达情况。构建并验证CrkⅡRNA干扰质粒,将培养后的Hep-2细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阴性对照组(转染阴性对照质粒)和实验组(转染CrkⅡ干扰质粒),细胞转染后行实时聚合酶链反应(PCR)扩增。采用蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后Hep-2细胞中CrkⅡ的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移能力,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率明显高于癌旁正常组织(P﹤0.01)。临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织分化程度为中低分化、有淋巴结转移喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅰ~Ⅱ期、组织分化程度为高分化、无淋巴结转移的喉癌患者(P﹤0.05)。实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA和蛋白的相对表达量均低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。实验组穿过基质膜至下室的细胞数目低于阴性对照组和空白对照组(P﹤0.05)。转染48 h时,实验组细胞的迁移率低于阴性对照组、空白对照组(P﹤0.05)。细胞培养24、48、72 h时,实验组Hep-2细胞的光密度(OD)值均低于空白对照组和阴性对照组(P﹤0.05)。结论喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ的表达下调可降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,CrkⅡ有可能成为喉癌临床治疗的新靶点。

CRKⅡ对慢性粒细胞白血病K562细胞恶性行为的影响

作为信号接头蛋白CRK家族成员之一,CRKⅡ参与细胞的增殖、存活、黏附、迁移、分化,但CRKⅡ与白血病的关系及作用机制尚不清楚。采用qRT-PCR(quantitative real-timePCR)检测CRKⅡ在正常人外周血样本、非恶性白血病患者骨髓样本、慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)初发患者骨髓样本、CML完全缓解(complete remission,CR)患者骨髓样本中的表达情况;CRKⅡ小干扰序列瞬时转染K562细胞,获得CRKⅡ表达下调的K562细胞株,Western blot和qRT-PCR检测CRKⅡ干扰效率;CCK8检测CRKⅡ下调对K562细胞增殖能力的影响;Transwell小室检测CRKⅡ下调对K562细胞迁移、侵袭能力的影响;Western blot检测CRKⅡ下调对K562细胞中信号通路关键分子p130Cas、Rac1表达水平的影响。与正常人外周血样本、非恶性白血病患者骨髓样本相比,CRKⅡ在CML初发患者骨髓样本中表达水平升高,同时在4对CML初发-CR配对样本中,患者完全缓解后CRKⅡ表达水平降低;在K562细胞中CRKⅡ表达被有效沉默;CRKⅡ下调抑制K562细胞的增殖、迁移、侵袭能力。初步分子机制研究发现,CRKⅡ通过激活p130Cas/DOCK180/Rac1通路调节K562细胞的恶性行为。CRKⅡ在CML发生、发展中起着重要的作用,作为肿瘤促进剂影响CML细胞的恶性行为,可作为CML诊断、治疗的新靶点。

接头蛋白CrkⅡ在喉鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

目的研究接头蛋白CrkⅡ在喉鳞状细胞癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学(SP)法对54例喉鳞状细胞癌手术切除标本进行检测,分析CrkⅡ的表达同患者的年龄、临床分期、病理分级、有无淋巴转移的关系。结果 CrkⅡ在癌旁正常组织中不表达或少量表达,在喉鳞癌组织中的阳性表达率为68.5%,且其表达在肿瘤的临床分期、病理分级及有无淋巴结转移方面差异有统计学意义(χ~2=9.643,χ~2=4.987,χ~2=3.833,均P<0.05)。结论 CrkⅡ蛋白可能通过促进癌细胞的侵袭、转移在喉鳞状细胞癌的发展过程中发挥重要作用。

CRK是PTPN4新的相互作用蛋白

以PTPN4为“诱饵”，利用酵母双杂交系统筛选人肝cDNA文库，获得了一个与PTPN4相互作用的蛋白：CRKⅠ．从cDNA文库中通过PCR得到CRK家族的3个成员的基因，把这3个基因与PTPN4共转酵母，发现CRKⅠ、CRKⅡ和CRKL均能与PTPN4发生很强的相互作用．通过截断体证实它们之间的相互作用是通过CRKs的SH3结构域与PTPN4的462-468位的脯氨酸富集区介导的．免疫共沉淀以及免疫荧光共定位实验进一步证实了CRKI与PTPN4的相互作用．通过酪氨酸磷酸化特异性抗体检测发现PTPN4可以明显降低CRKI的磷酸化水平．