地高辛标记的血小板T细胞活化抗原1cRNA探针的制备与鉴定

目的制备用地高辛 (digoxigenin ,Dig)标记的血小板T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)cRNA探针。方法构建重组质粒 pGEM 3ZF( +) PTA1 ,并做序列分析证实PTA1基因的插入方向正确后 ,用EcoRI消化得到线性DNA片段 ,再用SP6RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链cRNA探针。结果经斑点杂交证实 ,该探针敏感性高、特异性强。结论地高辛标记PTA1cRNA探针的制备 ,为进一步研究PTA1mR NA在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。

地高辛精标记cRNA探针原位杂交法检测大鼠胃肠胰系统生长抑素mRNA

目的：建立敏感的非放射性原位杂交技术检测胃肠调节肽基因的表达．方法：用体外转录法制备地高辛精（Ｄｉｇ）标记生长抑素ｃＲＮＡ探针，在４％多聚甲醛固定的胃、十二指肠和胰腺恒冷箱切片标本上进行了原位杂交，结果：杂交阳性部位呈紫蓝色，位于胞浆，背景浅淡，反差强烈．含生长抑素ｍＲＮＡ细胞与以前所报道的生长抑素免疫反应细胞的形态、分布均一致。结论：Ｄｉｇ标记ｃＲＮＡ探针原位杂交法敏感、简便、迅速、可靠，可用于胃肠调节肽基因表达的研究．

甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义

目的探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法和意义。方法取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经HindⅢ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验。结果TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性。核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果一致。结论成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况。

地高辛标记cRNA探针原位杂交检测大鼠脑NMDAR-LmRNA

采用地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｄｉｇ）标记神经递质受体ＮＭＤＡＲＬｃＲＮＡ探针技术进行原位杂交，研究了Ｗｉｓｔａｒ 新生大鼠脑神经细胞ＮＭＤＡＲＬ的基因表达．光学显微镜观察结果显示，大脑皮层、海马等区有明显的ＮＭＤＡＲＬｍＲＮＡ表达，胞浆着蓝色，胞核不着色，背景浅淡，反差显著．实验结果表明地高辛标记ｃＲＮＡ探针能快速、准确地检测出ＮＭＤＡＲＬｍＲＮＡ，为进一步研究这一拟受体在脑中表达和分布奠定了基础．

地高辛标记大鼠下丘脑生长激素释放因子cRNA探针的制备及应用

目的:制备地高辛标记大鼠下丘脑释放因子cRNA探针.方法:大鼠下丘脑生长激素释放因子的重组质粒cDNA PGEM4经转化扩增后,用碱性裂解法获取质粒cDNR并纯化.用限制性内切酶ECORI酶切,以线性cDNA为模板.在T_7和Sp_6RNA聚合酶作用下.采用体外转录法分别合成地高辛素标记的大鼠下丘脑生长激素释放因子cRNA和RNA探针.实验采用原位杂交技术.以cDNA为探针,检测大鼠下丘脑中生长激素释放因子mRNA的分布.检测Dig-cRNA探针的灵敏度.结果:生长激素释放因子神经元呈圆形或多边形.主要集中于下丘脑弓状核团和腹内侧核团的周缘,此外.在下丘脑视前区、视交叉上核区域及视上核的结节部.还可见散在的神经元分布.结论;在对GHRF的进一步研究中,Dig-rhCHRFcRNA探针必将作为一种有力的工具而发挥重要的作用.

褪黑素受体Mel_(1a)和 ROR_β的基因克隆和 cRNA探针的制备(英文)

为了研究褪黑素受体在人脑中的表达状况以及褪黑素在老年性痴呆中的作用 ,本研究克隆了 Mel1 a和 RORβ等两种褪黑素受体的 c DNA并将其转入 p Bluescript ( KS+)质粒载体中。重组质粒通过限制性内切酶鉴定分析并测序。结果表明 ,克隆的序列与 Gen Bank中的序列一致。利用线性化的质粒模板反转出 c RNA探针 。

DIG 标记的 cRNA 探针用于原位杂交最佳条件探讨

对地高辛（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ，ＤＩＧ）标记的反义ＲＮＡ探针用于原位杂交的技术问题进行研究。结果表明：①杂交标本取材后应在１ｈ内放入固定液，时间过长，杂交信号明显降低；②探针工作浓度以０．４ｍｇ／Ｌ为宜，过高或过低影响杂交背景或阳性率；③防止ＲＮａｓｅ的污染是技术成败的关键之一；④杂交温度和时间以４３℃，１６ｈ为宜；⑤防止脱片是原位杂交的基本技术需要。

小鼠Brd2基因探针的制备及其在荧光原位杂交实验中的应用

目的:为观察溴结构域包含蛋白2(bromodomain containing protein 2,Brd2)基因在小鼠中枢神经系统的表达与分布,本研究制备了两条地高辛标记的Brd2 cRNA探针。方法:提取小鼠脑组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增得到两个Brd2的DNA片段,并将它们分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中。利用体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针,最后通过荧光原位杂交实验分析所标记探针的特异性及杂交效果。结果:本实验成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,获得了特异性的地高辛标记的Brd2cRNA探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针得到了较好的杂交信号。结论:本实验制备的地高辛标记的cRNA探针可特异地检测Brd2 mRNA,为进一步观察Brd2 mRNA在中枢神经系统的分布及功能研究提供了工具。

神经生长导向因子Slit mRNA在人胚胎脊髓的原位杂交定位

目的 检测神经生长导向因子SlitmRNA在人胚胎脊髓中的定位表达。方法 地高辛标记的cRNA探针原位杂交技术。结果 SlitmRNA在脊髓中央管、前角和后角处表达。结论 神经生长导向因子Slit在人胚胎脊髓发育期轴突投射和神经通路形成中可能起重要作用。

TIMP-1在肝纤维化形成过程中的作用

目的 研究TIMP 1在肝纤维化形成过程中的作用。方法 皮下注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型 ;RT PCR扩增TIMP 1cDNA片段 ,定向克隆到转录载体pSPT18上 ,构建pSPT18/TIMP 1重组质粒 ,转化E .coliJM10 9,进行质粒提取、酶切鉴定、序列分析、体外转录合成探针、原位杂交。结果 成功建立小鼠肝纤维化模型 ;获得的TIMP 1目的基因片段大小为 2 6 2bp ,与预期结果相同 ;经酶切鉴定和序列分析证实成功构建了pSPT18/TIMP 1重组质粒 ;原位杂交结果显示 ,TIMP 1主要在激活的肝星型细胞、内皮细胞、间质细胞以及正常肝细胞中表达 ,且随着肝纤维化的逐步形成 ,TIMP 1的表达逐渐升高。结论 TIMP 1参与肝纤维化的形成过程 。

通过组织芯片分析snail、claudin-1 mRNA表达与胃癌的关系

目的探讨snailmRNA和claudin-1mRNA在胃癌中的表达及其与临床病理特征及预后的关系。方法制备组织芯片和cRNA探针,通过原位杂交检测snail和claudin1的mRNA在胃癌和正常胃粘膜组织中的表达。结果胃癌和正常胃粘膜中snail和claudin-1的mRNA表达率差异明显。snailmRNA表达与胃癌的分化、TNM分期、脉管及淋巴结转移呈正相关;claudin1mRNA表达与TNM分期、浸润深度、脉管及淋巴结转移呈负相关。两者均有助于判断胃癌预后,claudin1mRNA还可作为判断胃癌预后的独立风险因素。结论snailmRNA与claudin-1mRNA的表达影响胃癌发展,是指导临床治疗及估计预后的有意义指标。

应用原位杂交技术分析ZNF216基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式(英文)

目的 :获得ZNF2 16基因的表达模式。方法 :体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针 ,利用原位杂交技术检测ZNF2 16基因在成年小鼠各主要组织中的表达模式。结果 :在小鼠脑、心脏、骨骼肌和睾丸细胞内可检测到很强的ZNF2 16的杂交信号 ,在肾脏细胞内也可检测到杂交信号 ,但在脾脏和肝脏细胞内仅检测到少许杂交信号和未能检测到杂交信号。结论 :ZNF2 16基因表达于几种组织细胞内 ,具有一定的组织特异性。

FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌组织中的表达

用植物凝集素激活正常人单核细胞 ,诱导 Fas L m RNA表达 ,提取总 RNA,经逆转录多聚酶链反应( RT- PCR)筛选 Fas L基因片段。定向克隆入质粒 p SPT1 9,多克隆位点获取重组质粒 ,经 DNA测序后体外转录制备 Dig- Fas L c RNA探针。收集经病理证实的肺癌及癌周正常肺组织新鲜标本 ,用液氮速冻 ,4%多聚甲醛固定。在冰冻切片上以 c RNA探针原位杂交进行 Fas L m RNA表达分布的观察。结果 :在鳞癌、腺癌和小细胞肺癌的癌组织及癌旁肺组织中均可检出 Fas L的杂交信号。镜下见鳞癌组织中 Fas

皮肤晚期反应标本中IL-6和IL-8 mRNA的表达及意义

为探讨 IL - 6和 IL - 8在皮肤晚期反应 ( L PR)标本中的变化 ,采用原位杂交技术 ,测定了 IL - 6和 IL - 8m RNA在 14例夏季枯草热患者变应原诱导的 L PR标本中的表达。 14例标本中 ,两种细胞因子表达的阳性率分别为 85 .7% ( 12 / 14 )和 92 .8% ( 13 / 14 ) ;与对照标本比较 ,变应原攻击标本中表达上述细胞因子 m RNA的阳性细胞数明显增加 ( P<0 .0 1)。提示 IL- 6和 IL- 8在 L PR的发病中起重要作用。

上皮性卵巢癌组织中DPPⅣ mRNA的表达及意义

目的探讨上皮性卵巢癌组织中二肽基肽酶(DPP)mRNA的表达及临床意义。方法设计5′端含有T7RNA聚合酶启动子序列的PCR引物,以质粒pcD26His的cDNA为模板扩增得到DNA片段,并在T7RNA聚合酶作用下,采用体外转录方法合成FITC标记的DPP RNA探针,对86例卵巢上皮性癌石蜡包埋组织进行原位杂交,检测其DPP mRNA的表达,12例正常卵巢组织作对照。结果86例卵巢癌组织中的DPP mRNA0、1、2、3级表达者分别为2、18、40和26例,阳性表达率为97.67%(84/86),显著高于对照组的16.66%(2/12),P<0.01;其表达与卵巢癌组织学分级和临床分期有关。结论DPP mRNA在卵巢癌组织中的表达增高,在卵巢癌的发生发展中起一定作用。

FWA116基因在心衰动物模型心脏血管内皮的表达

建立亚急性和慢性心衰SD大鼠模型,用RNA-RNA原位杂交方法观察新基因FWA116在心脏组织的表达。以重组质粒FWA116/PGEM-T线性cDNA为模板,在T7耵或SP6RNA聚合酶作用下,体外合成地高辛(DIG)半抗原标记的FWA116cRNA探针。结果表明:与对照组相比,该基因在两种心衰大鼠心脏的中、小动脉内皮组织的mRNA表达均明显增高;与Northern blot及免疫组化的结果相一致,这提示DIG标记cRNA原位杂交方法的敏感和可靠。同时FWA116基因在心衰缺血缺氧心脏动脉内皮中的转录和翻译水平的高表达,说明该基因可能在心衰的病理过程中起到重要的作用。

Scribble在原肠期鸡胚表达的研究

旨在研究极性脚手架蛋白Scibble(Scrib)在原肠期的表达及意义,明确Scrib在早期鸡胚发育中的作用。以含有全长人Scrib的质粒pEGFP-N2-Scrib作为模板克隆出N端一段770 bp左右的片段,从而构建一个新的质粒pSPT18-Scrib;以pSPT18-Scrib为模板进行体外转录制备cRNA探针;并采用原位杂交的方法用此探针检测鸡原肠胚各个时期Scrib的表达情况。结果显示,Scrib在鸡胚四期开始逐渐在原条顶端及两侧的外胚层表达,并随着发育过程向外胚层两侧蔓延扩散,并且在发展到十期时呈现包括神经管和体节在内的广泛的弥散性表达。Scrib的表达规律提示在胚胎发育早期Scrib对外胚层细胞迁移和分化以及而后的器官发生起到重要的作用,为进一步研究Scrib在鸡胚早期发育中的作用提供参考。