蛋白激酶D抑制剂CRT0066101对唾液腺腺样囊性癌细胞迁移能力的影响

目的观察蛋白激酶D(PKD)的抑制剂CRT0066101对唾液腺腺样囊性癌(SACC)细胞迁移能力的影响,并探讨其相关机制,为SACC治疗提供新策略。方法将不同浓度的CRT0066101作用于SACC-LM细胞,通过蛋白质印迹(Western blot)和细胞免疫荧光染色检测CRT0066101对细胞PKD磷酸化活化的作用;Transwell实验检测CRT0066101对细胞迁移能力的影响;利用Western blot、细胞免疫荧光染色和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测药物对上皮间充质转化(EMT)相关指标蛋白的影响;用蛋白酶体抑制剂处理CRT0066101作用后的细胞和对照细胞,Western blot检测锌指转录因子(Snail)蛋白的表达。结果CRT0066101能抑制PMA诱导的SACC-LM细胞PKD磷酸化;降低细胞迁移数。CRT0066101能降低N-钙黏着蛋白和Snail蛋白表达量,增加E-钙黏着蛋白和CDH1基因的表达。CRT0066101能调控蛋白酶体介导的Snail蛋白降解。结论CRT0066101抑制SACC-LM细胞迁移能力,调节EMT相关蛋白和基因表达,机制可能与蛋白酶体介导的Snail蛋白降解有关。

蛋白激酶D在人类冠状病毒229E复制中的作用及机制研究

目的探究蛋白激酶D(PKD)在人类冠状病毒229E(HCoV-229E)复制中的作用及潜在分子机制。方法以MRC-5细胞作为模型,采用qPCR和Western blot检测PKD家族基因和蛋白的表达水平;通过siRNA敲除Prkd3及PKD抑制剂(CRT0066101)抑制PKD活性,检测HCoV-229E感染细胞后的复制水平;通过CCK8检测细胞活性,TCID_(50)测定病毒滴度,免疫荧光染色检测HCoV-229E的表达和反式高尔基体网络(TGN)的结构;通过检测磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)的水平反映磷脂酰肌醇4-激酶IIIβ(PI4KIIIβ)活性;采用PI4KIIIβ抑制剂(BQR695)抑制PI4KIIIβ活性,检测HCoV-229E感染细胞后的TGN的结构变化和HCoV-229E复制水平;采用CRT0066101抑制Vero-E6细胞的PKD活性,检测HCoV-229E感染后的的复制水平。结果PKD家族基因和蛋白表达水平在HCoV-229E感染过程中明显增加,包括Prkd1、Prkd2和Prkd3;与对照组相比,敲低PKD3显著抑制HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=8.999,P<0.001;t=6.920,P<0.001),过表达PKD3则增加了HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=6.630,P<0.001;t=5.794,P<0.001);CRT0066101也显著抑制HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=6.931,P<0.001;t=4.055,P<0.01),免疫荧光染色结果表明,CRT0066101抑制HCoV-229E感染导致的TGN裂变;抑制PI4KIIIβ活性显著降低PI(4,5)P2水平,且BQR695挽救了PKD过表达导致的PI(4,5)P2水平升高(t=6.671,P<0.01),BQR695降低了HCoV-229E感染细胞的TGN裂变,HCoV-229E mRNA水平和滴度(t=5.151,P<0.001;t=7.744,P<0.001);CRT0066101抑制HCoV-229E在Vero-E6细胞中的mRNA水平和滴度(t=7.480,P<0.001;t=7.228,P<0.01)。结论本研究揭示了PKD通过调控PI4KIIIβ影响TGN的裂变参与HCoV-229E复制,并证明PKD抑制剂和PI4KIIIβ抑制剂对降低HCoV-229E的复制具有显著作用,这些发现为今后研究冠状病毒感染的治疗提供重要的参考依据。