苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3株的cry基因分析及杀虫特性

筛选的苏云金芽孢杆菌野生菌株 1 5A3经鉴定属血清H 2 1型科默尔亚种。用PCR及RFLP方法对其cry1类基因分析证明其含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ca,cry1D ,cry1I及cry2六种cry基因 ,其cry1A基因N末端 1 45kb片段与已发表的序列有差异。表达晶体蛋白质的分子量分别为 1 3 0 ,79,70 ,6 5 ,5 1和 45kD。对家蝇致畸实验证明其不含 β 外毒素。发酵液对棉铃虫 ,甜菜夜蛾 ,小菜蛾及美国白蛾均具较高的毒力。

苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究

建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂交用量(0.625～20μg)的对数值与信号值的对数值之间存在明显的线性关系(r2=0.985～0.989)。

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。

中国苏云金芽孢杆菌的分布与cry基因的多样性

采集全中国 2 7个省、自治区及 4个直辖市昆虫孳生地粉尘、土壤等样品 1 0 80份 ,在其中的40 6份中分离到苏云金芽孢杆菌 965株。镜检可观察到大菱形、小菱形、方形、长方形、圆形、椭圆形、镶嵌形和不规则形等 8种主要形态的伴孢晶体 ;采用cryⅠ、cryⅡ、cryⅢ、cryⅣ和cryⅤ基因的通用引物对 2 2 1株Bt分离株进行的PCR检测结果表明 :各类基因的含量依次为cryⅠ >cryⅡ >cryⅤ>cryⅢ基因 ,分别占被检菌株的 75 6%、 67 9%、 58 4%和 1 4 5% ,没有检测到cryⅣ基因 ,共得到1 0种基因组合类型。对其中含有cryⅠ基因的菌株分别以cryIAc、cryIC和cryIE基因的特异性引物进行PCR检测 ,得到 2 0株同时含有cryIAc、cryIC、cryⅡ和cryⅤ优良基因组合的Bt分离株 ,其中菌株Bt 1 5A3对棉铃虫、甜菜夜蛾及小菜蛾均表现出高毒力 ,具有生产开发潜力。

苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展

从cry基因的分类、cry基因与转座因子的关系、cry基因的表达调控以及cry基因的作用机理等 4个方面综述了cry基因的研究进展 ,并简要展望了其研究和应用前景。

Cry基因家族的专利分布研究

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)提取的Cry基因,是目前国内外开发应用最为广泛的抗虫基因,具有巨大的潜在经济价值。自上世纪80年代以来,美欧日等发达国家加速利用知识产权在Cry基因技术领域布阵设防,建立了严密的知识产权攻防体系,掌控着相关产业发展的主动权。通过检索搜集全球范围内的Cry基因专利信息,分析研究了Cry基因家族的专利分布状况,借此对我国在制定技术研发和产业化策略时,有效规避知识产权陷阱提供决策依据。

苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性

研究了几种Btcry基因于大肠杆菌 (Escherichiacoli)中表达产物在pH 10 0的 5 0mmol/L碳酸钠和 2 0mmol/L乙醇胺溶解液中的溶解性 ,发现同样的Cry蛋白在碳酸钠中的溶解度大于乙醇胺。通过胰蛋白酶消化 ,明确Cry1Ca7、Cry1Ia8酶解产物为 38kD多肽 ;Cry1Ie1、Cry1Cb2、Cry2Ab4酶解产物为 4 1kD多肽 ;Cry1Ac酶解产物为 6 0kD多肽。采用FPLC层析方法对 6种原毒素及其酶解后得到的毒素多肽进行了分离纯化 ,比较了原毒素和毒素的杀虫活性的差异。其结果表明 ,Cry1Ac的原毒素和毒素对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率均为 10 0 % ,Cry2Ab4的原毒素的毒力高于其酶解毒素。

苏云金芽孢杆菌高效菌株cry基因分析及多价基因组合的研究

对本室筛选的高活性Ｂ．ｔ．野生株进行了ｃｒｙ 基因检测，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明ｃｒｙＩＡｃ和ｃｒｙ１Ｃ位于质粒上．利用接合转移和电穿孔转化等方法对这些菌株进行了遗传改良研究．结果表明：高效野生株７４０４、ＨＤ－１－Ｘ和９５１０ 不易获得并表达外源ｃｒｙ 基因，而高效野生株Ｂｔｉ． ｔ－１８９７ 的电转化频率较高，并获得以Ｂｔｉｔ－１８９７ 为受体，对甜菜夜蛾、棉铃虫、黏虫和淡色库蚊均有毒力，具有ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＣ、ｃｒｙＩＶ及ｃｙｔ多价基因的广谱工程菌株．

红树林沉积物Bt菌株的分离与cry基因型的鉴定

从收集自泉州洛江红树林保护区的400个沉积物土壤样品中,分离到18株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt).利用PCR-RFLP体系对Bt菌株杀虫晶体蛋白的基因型进行了鉴定,发现15株Bt含有cry1基因,4株含有cry2基因,有3株分别含有cry7、cry8、cry9基因.克隆了一个新型的cry2Ab基因,其编码蛋白与现有Cry2Ab型杀虫晶体蛋白的最高同源性为95%.

梅花鹿粪便中苏云金杆菌分离株的生物学特性及其cry基因型鉴定

从福州动物园采集梅花鹿粪便,采用醋酸钠-抗生素分离法分离到1株苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)MHL0702,为了解该新菌株的生物学特性,对其进行了形态学、生理生化指标研究;通过PCR-RFLP鉴定体系对其cry基因型进行分析。结果表明:该菌株含有cry1Aa、cry1Ba、cry1Ea和cry1Ia类基因。对3日龄小菜蛾幼虫的室内毒力测定结果显示,该菌株对重要的农业害虫小菜蛾有较高的杀虫毒力。

牡丹江火山口原始森林苏云金芽孢杆菌的分离和cry基因鉴定

对牡丹江火山口原始森林苏云金芽孢杆菌的分布与基因多样性进行研究.采集91份土壤样品,利用温度筛选法从中分离出40株苏云金芽胞杆菌并对其进行光学显微观察,晶体形态为球形和菱形.PCR-RFLP鉴定结果表明:该地区的苏云金芽胞杆菌含有cry1,cry2,cry4,cry8,cry9,cry18,cry26,cry28,cry35基因,含cry8基因的菌株最丰富;苏云金芽孢杆菌在火山口原始森林的分布具有良好的多样性.

四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定

[目的]对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。[方法]从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR-RFLP及SDS-PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。[结果]从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1c、ry1 Ic、ry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白,2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白,4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白,2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白,1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明:9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。[结论]四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。

海南五指山热带雨林区Bt菌株的分离及其新型cry基因鉴定

五指山原始热带雨林区位于海南岛中部,是海南岛地区面积最大的热带原始雨林。我们依据不同的海拔高度对五指山原始雨林区进行了系统的取样,共采集了234份土壤样品,采用醋酸钠-高温处理的方法分离出各类产芽孢杆菌886株,并通过显微镜观察鉴定出产伴胞晶体蛋白的Bt菌株21株,其Bt菌株分离率为2.3%。为了进一步挖掘五指山丰富的Bt杀虫基因资源,还利用PCR方法结合测序技术对21株Bt分离株的cry基因进行了鉴定,鉴定结果显示cry1、cry4、cry39、cry40、cry31和cry46等基因型存在,表明五指山热带Bt菌株含有丰富cry基因资源,这将为为进一步开展Bt杀虫基因的分离克隆打下基础。

一株具有烟草甲幼虫毒杀作用苏云金芽孢杆菌的遗传多样性分析及cry基因鉴定

【目的】明确一株具有烟草甲幼虫毒杀作用苏云金芽孢杆菌在蜡样芽孢杆菌群中的进化关系,并对该菌株所携带的cry基因进行鉴定,为其在农业上的开发应用提供参考依据。【方法】对苏云金芽孢杆菌GXZY032菌株的16S rRNA和gyrB基因序列进行PCR扩增测序,并进行相应的进化树分析;使用PCR技术对GXZY032菌株基因组所包含的cry杀虫基因进行鉴定。【结果】菌株GXZY032的16S rRNA序列经PCR扩增得到1.5 kb片段,在进化树中以较低的置信值与多个BtII群菌株聚到一起。gyrB基因序列经PCR扩增并测序得到1.2 kb片段,所构建的进化树有6个置信值较高的分支,构成BtI、BtII、B.cereus I、BtIII、Bt+Bw和Bt+Ba 6个群,其中菌株GXZY032的序列与BtII群聚集一起,置信值为99%。对8种cry基因进行PCR鉴定,结果表明,菌株GXZY032包含cry1、cry2和cry10 3种类型cry基因。【结论】苏云金芽孢杆菌菌株GXZY032属于BtII群,具有cry1、cry2和cry10 3种类型cry杀虫基因。

苏芸金杆菌cry基因的遗传学分析及基因工程进展

苏芸金杆菌ｃｒｙ基因的遗传学分析及基因工程进展李扬，任改新（南开大学生命科学学院微生物系，天津３０００７１）１引言苏芸金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ简称Ｂｔ）是一种微生物杀虫剂，在农林、卫生害虫的综合防治中占有极其重要的地位。...

苏云金芽胞杆菌cry基因研究进展

从cry基因的分类、鉴定、遗传特性以及应用概况等4个方面综述了苏云金芽胞杆菌cry基因的研究进展,并对cry基因的研究进行展望。

苏云金芽胞杆菌LM1212菌株cry基因启动子的活性分析

【背景】前期发现一株具有独特分化表型的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)LM1212,该菌株共有14种杀虫基因,组成了10个转录单元。利用源自菌株LM1212的晶体产生细胞调控因子(crystal producing cell regulator,CpcR)以及其可以激活的cry35-like基因启动子,已在典型Bt菌株HD73中成功构建了非芽胞杀虫蛋白表达体系。【目的】比较菌株LM1212的不同杀虫基因启动子的转录活性,明确可被转录因子CpcR激活的且转录活性较高的启动子,以此为基础优化非芽胞杀虫蛋白表达体系。【方法】将10个启动子区域分别与lacZ报告基因融合构建在pHT304-18Z载体上,得到了10个重组质粒;然后将cpcR基因及其启动子(PcpcR-cpcR)分别反向构建在选取的启动子区域与lacZ报告基因的上游,得到可以表达CpcR且与上述构建相对应的10个重组质粒,将这些重组质粒分别转入不含CpcR的菌株HD73,即获得20个可用于测定β-半乳糖苷酶活性的重组菌株。通过光学显微镜观察和SDS-PAGE检测明确杀虫蛋白表达的情况。【结果】在菌株HD73中,β-半乳糖苷酶活性检测结果显示,启动子P1、P3、P4、P5、P6、P7和P8转录均可被转录因子CpcR激活,启动子P10的转录受到转录因子CpcR抑制。在CpcR存在时,P7、P8启动子的转录活性相对较高。利用转录因子CpcR和P7、P8启动子成功表达了对草地贪夜蛾有较高杀虫活性的Vip3Aa11蛋白。【结论】筛选到的高转录活性的启动子可用于优化非芽胞杀虫蛋白表达体系,从而构建新型工程菌,为草地贪夜蛾的生物防治提供新思路。

31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究

利用已建立的苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系 ,鉴定了 31株Bt菌株的cry基因类型 ,并进行了SDS PAGE分析和杀虫生物活性测定。研究表明 :2 5株含cry1基因 ,表达蛋白 1 30～ 1 50kD ;其中 1 6株含有对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有活性的cry1I基因 ,其表达蛋白为 81kD ;1 5株同时含有cry1和cry2基因 ( 1 3株表达蛋白约为 60kD) ;1 0株含有未知待定基因 ;6株不含所鉴定的cry基因 (其中 2株有表达产物 )。室内生物测定表明 :cry1、cry2基因表达的菌株对鳞翅目害虫具有高杀虫活性 ,7株对舞毒蛾和膜翅目———杨叶蜂幼虫具有较高杀虫活性 ;含有cry1Aa、cry1Ac、cry2或cry1Ab、cry1Ac、cry2基因组合的菌株对棉铃虫幼虫均显示杀虫活性 ,其中 6、1 2、30号菌株毒力最强。不含上述cry基因的菌株均无杀虫活性。以上结果证明 ,通过cry基因类型鉴定和表达产物的SDS PAGE分析可以预测菌株的杀虫活性。