Cry1Ab杀虫蛋白在水稻-褐飞虱-拟水狼蛛食物链中转移与富集

采用ELISA方法检测了2个转 cry1Ab 基因水稻 (Bt水稻) 品系KMD1和KMD2不同生育期叶鞘内Cry1Ab杀虫蛋白的含量及其通过褐飞虱和拟水狼蛛的转移和富集情况。结果表明, 这2个品系中抽穗期和黄熟期叶鞘内Cry1Ab的含量均显著低于苗期、分蘖期和孕穗期, KMD1和KMD2中Cry1Ab杀虫蛋白可以通过食物链转移到Bt水稻非靶标害虫褐飞虱及其天敌拟水狼蛛体内。褐飞虱在KMD1或KMD2上取食2 d后, 体内均含有 Cry1Ab杀虫蛋白, 但连续取食2、4、6、8和10 d后,其体内含量并未因取食时间的延长而呈现明显增加的趋势。当拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 在捕食2、4、6、8和10 d后, 其体内均可检测到Cry1Ab杀虫蛋白, 其含量并未随捕食时间的延长而明显上升, 但均显著高于相应时间褐飞虱体内的含量。可见, 该蛋白可通过水稻转移至褐飞虱, 再转移至拟水狼蛛, 并存在明显的富集现象, 而这种富集并不随蜘蛛捕食时间的延长而加强。拟水狼蛛捕食以KMD1或KMD2为食的褐飞虱时, 其捕食量未受到显著影响, 其中肠酶粗提物对Cry1Ab杀虫蛋白具有明显的降解作用。

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。

Bt水稻Cry1Ab杀虫蛋白表达的时间动态及其在水稻土中的降解

采用ELISA技术检测了Bt水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)不同生育期茎和叶片中cry1Ab基因的表达水平,以及植株组织(茎和叶片)室内埋于不同稻田土壤中其Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态。结果表明,不论是KMD1还是KMD2,茎和叶片中cry1Ab基因的表达量为3.7～9.1μg/g鲜重,均以拔节期和孕穗期相对较低,灌浆初期显著升高,黄熟期又明显下降(但仍然维持在较高的表达量)。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白在3种水稻土即青紫泥田、黄松田和黄筋泥田中的降解,均以前期(处理后12d内)较快,但中后期明显较慢;处理后42d,这两种组织中的Cry1Ab残留量均稳定在μg级水平,分别仅有0.20～0.85μg/g干重和0.35～1.81μg/g干重。KMD1茎和叶片中Cry1Ab蛋白降解动态与土壤类型密切相关,青紫泥田中降解最快,黄筋泥田中次之,黄松田中最慢。淹水可加快土壤中茎和叶的腐解,从而促进其中Cry1Ab蛋白的降解。KMD2粉碎叶中Cry1Ab蛋白在有菌水稻土中的降解快于无菌土中,表明土壤微生物存在可加快Cry1Ab蛋白的降解。在各种土壤淹水与非淹水、灭菌与非灭菌处理条件下的Cry1Ab蛋白降解过程均可用指数方程进行拟合,算得其消减半衰期为2.2～11.6d不等。讨论了土壤类型、淹水等影响Cry1Ab蛋白降解的可能机制,认为土壤微生物是其中起关键作用的一个因子。

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。

转Bt基因抗虫玉米植株叶腋处花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

以表达Cry1Ab杀虫蛋白的两种转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法研究了玉米散粉时沉积在植株叶腋处Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态,比较了两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度.结果表明,Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白是逐渐降解的,且降解速度逐渐加快.但两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,MON810中的Bt杀虫蛋白降解较快,而Bt11中的降解较慢.d15时在MON810叶腋处的花粉中已经检测不到Bt杀虫蛋白,而在Bt11花粉中Bt杀虫蛋白到d18才完全降解.两种Bt玉米花粉中杀虫蛋白的初始含量差异显著,且在各个取样时间内Bt杀虫蛋白的残留量存在显著差异.玉米散粉时留在田间的Bt玉米花粉中的Cry1Ab杀虫蛋白不会在自然界累积.

影响Bt稻离体叶中Cry1Ab杀虫蛋白降解的环境因子研究

目的研究转Bt基因水稻表达的外源Bt杀虫蛋白在土壤中的环境去向,以便进行转BT基因水稻的生态风险性评价。方法室内采用ELISA法,研究转Bt基因水稻克螟稻2号(KMD2)粉碎叶片中Cry1Ab杀虫蛋白在3种水稻土,即青紫泥田、黄筋泥田和黄松田土中不同土壤含水量、土壤pH值和温度条件下的降解动态。结果供试叶片粉中Cry1Ab蛋白在3种水稻土中的降解动态均可用一级化学反应动力学指数方程来拟合,降解半消减期t0.5为1.8～4.0d。结论土壤含水量、pH和温度对Cry1Ab蛋白降解速率均有一定影响,但pH和温度的影响更为明显。通常pH较低的酸性土壤和低温不利于土壤中Cry1Ab蛋白的降解,特别是在酸性黄松田中降解最慢。

Cry1Ab杀虫蛋白对淡足侧沟茧蜂生长发育的影响

以黏虫[Mythimna separata(Walker)]为寄主,研究了亚致死浓度的Bt杀虫蛋白Cry1Ab对淡足侧沟茧蜂[Microplitis pallidipes(Szepligeti)]生长发育的影响。结果表明,当寄主从淡足侧沟茧蜂寄生后开始取食含Cry1Ab杀虫蛋白浓度为1、2、4μg/g和8μg/g的饲料时,淡足侧沟茧蜂卵-幼虫发育历期比以对照黏虫为寄主的显著延长,茧(蛹)重和成虫体重显著下降,但对茧历期及成虫寿命没有显著影响。淡足侧沟茧蜂的卵-幼虫发育历期随着寄主取食Cry1Ab杀虫蛋白浓度的增加而显著延长,茧重和成虫体重则随Bt蛋白浓度的上升而显著下降。因此,尽管Cry1Ab杀虫蛋白对淡足侧沟茧蜂的生长发育具有一定程度的负面影响,但其仍可以在取食Bt毒蛋白的黏虫上完成整个世代发育。

Bt稻Cry1Ab杀虫蛋白在水体中的残留和Bt稻田三类水生昆虫数量调查

以转Btcry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)黄熟期的茎叶为材料,室内测定了其经浸水处理后(28℃,L16∶D8)残体和水体中Cry1Ab杀虫蛋白的含量;测定了KMD1与早籼稻嘉早935培育成的Bt稻华池B6分蘖期稻田水体中Cry1Ab蛋白的含量,同时调查了该Bt稻和对照稻嘉早935在分蘖初期、盛期和末期稻田3类水生昆虫的数量。结果表明,KMD1和KMD2茎叶经浸水100d后,水体中残留有Cry1Ab杀虫蛋白。华池B6分蘖期稻田水体中没有检测到Cry1Ab蛋白;除分蘖末期华池B6稻田中的蜉蝣目昆虫个体数量显著高于对照田嘉早935外,其他2类水生昆虫摇蚊(spp.)和鞘翅目甲虫(sp.)在两类稻田间均无显著差异。

Bt抗、感种群亚洲玉米螟幼虫取食Bt玉米后Cry1Ab杀虫蛋白在其体内的组织分布与含量

采用ELISA方法检测了实验室汰选的对Cry1Ab产生107倍抗性的亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)种群与敏感种群3龄幼虫取食表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt玉米心叶后,杀虫蛋白在幼虫体内的分布情况。结果表明:Cry1Ab杀虫蛋白在抗性种群幼虫中的组织分布情况与敏感种群相近,主要存在于中肠组织和血淋巴中。抗、感种群中均以含有内含物的中肠组织中含量最高,分别为277.2 ng/g和104.9 ng/g;其次为血淋巴,分别为93.7 ng/g和69.5 ng/g;不含内含物的中肠组织中52.7 ng/g和40.1 ng/g;在丝腺和马氏管组织的含量很低,丝腺中分别为8.5ng/g和11.7ng/g,而马氏管中分别为6.7 ng/g和6.5 ng/g。脂肪体、生殖器官中未检测到杀虫蛋白。抗性种群中肠组织(含有内含物和不含内含物)中Cry1Ab的含量显著高于敏感种群。幼虫期取食过Bt玉米的亚洲玉米螟发育的蛹、成虫及其卵中均不含杀虫蛋白,说明Bt杀虫蛋白不会通过幼虫取食向蛹、成虫及卵传递。

寄生取食Cry1Ab杀虫蛋白的粘虫幼虫对伞裙追寄蝇寄生率及生长发育的影响

【目的】研究取食含Cry1Ab杀虫蛋白饲料的粘虫Mythimna separata(Walker)对其寄生天敌伞裙追寄蝇Exorista civilis Rondani的寄生率、生长发育和产卵量的影响。【方法】以取食含不同浓度(0,3.125,6.25,12.5和25μg/g)Cry1Ab杀虫蛋白饲料的粘虫幼虫为寄主,观察并记录伞裙追寄蝇的寄生和生长发育等指标。【结果】取食过不同浓度Cry1Ab蛋白的粘虫对伞裙追寄蝇寄生率、产卵量没有显著的影响(P≥0.05),即不会影响寄生蝇对寄主的选择。取食这5种浓度杀虫蛋白的粘虫上寄生的伞群追寄蝇发育历期(卵-幼虫、蛹、成虫产卵和世代)、羽化率、性比和产卵量均无显著差异(P≥0.05),但对蝇蛆存活率和蛹重影响显著(P<0.05)。其中,伞裙追寄蝇蝇蛆存活率以寄生在取食3.125μg/g Cry1Ab蛋白的粘虫上的最高(33%),并显著高于对照和其余3个浓度处理(P<0.05),但这4个处理之间的存活率差异不显著(P≥0.05)。伞裙追寄蝇的蛹重随寄主取食Cry1Ab杀虫蛋白含量的增加而显著下降(P<0.05)。其中对照的蛹重为49.8 mg,而寄生于取食6.25和25μg/g蛋白寄主上的蛹重分别只有41.0和36.7 mg。【结论】本实验结果表明寄主粘虫取食Cry1Ab蛋白对伞裙追寄蝇无显著负面影响,为科学评价田间转Bt基因作物对寄生蝇的影响作用提供了重要的科学依据。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析 ,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC 1 1中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白(Insecticidalcrystalprotein ,ICP)cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有 8个核苷酸不同 ,编码的蛋白有 7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank ,并命名为新亚型基因cry1Ab1 6(Ac .NO .AF375 60 8)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab1 6基因克隆到Escherichiacoli表达载体pQE30上并转化E .coliM1 5。Western印迹分析表明 ,E .coliM1 5表达了 1 30kD的Cry1Ab1 6蛋白 ,但此蛋白不稳定 ,大部分降解成65kD的蛋白。将表达Cry1Ab1 6蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾 (Plutellaxylostella)毒力测定 ,其LC50 为 2 5 8.3mg L ;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM0304叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1 Ab22的克隆与表达

【目的】克隆并表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiens,Bt)杀虫晶体蛋白cry1Ab22基因,为解决昆虫抗性问题提供有效途径,并为构建新型转基因工程菌和转基因植物提供基因材料。【方法】根据GenBank中cry1Ab型基因序列设计1对引物,并加入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点。用全长基因PCR产物粘端定向克隆的方法,从苏云金芽孢杆菌S249菌株中扩增到1个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白cry1Ab型基因cry1Ab22,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌TB1,进行诱导表达,并对表达产物的杀虫活性进行检测。【结果】cry1Ab22基因长度约为3.5 kb;其与已知的cry1Ab3型基因同源性最高,所编码的蛋白质存在5个氨基酸差异。cry1Ab22基因已在GenBank中登录,登录号为EU220269,并被Bt毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ab22。SDS-PAGE电泳结果表明,cry1Ab22基因表达了170 ku左右的融合蛋白。cry1Ab22蛋白对小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50为225.1μg/mL。【结论】S249菌株含有新型的cry1Ab基因,且该基因表达的蛋白具有较强的杀虫活性。

Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫中肠几种酶活性的影响

为阐明Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata(Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的生理学影响,本研究分析比较了粘虫高龄幼虫在室内取食低剂量Cry1Ac杀虫蛋白6,12,24和36h后,其体内主要的解毒酶(酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶)、保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)和中肠蛋白酶(总蛋白酶、强碱性类胰蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶)等活性的变化。结果表明,取食Cry1Ac杀虫蛋白后,粘虫幼虫体内相关酶活力呈现不同的变化趋势:(1)酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶(POD)、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力较对照显著降低(P<0.05);(2)超氧化物歧化酶(SOD)活力较对照显著升高(P<0.05);(3)过氧化氢酶(CAT)活力于6,12和24h显著低于对照(P<0.05),36h时显著高于对照(P<0.05)。结果提示Cry1Ac杀虫蛋白主要通过抑制粘虫幼虫中肠解毒酶和蛋白酶的活性,扰乱SOD,CAT和POD3种保护酶的动态平衡而干扰幼虫的正常生理代谢,从而起到毒杀粘虫的作用。

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 月下旬检测不到Bt 杀虫蛋白。

苏云金芽孢杆菌Cry1Ca7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白,为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因进行定点突变,获得了10种突变基因,通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突变毒蛋白有G138S,T221D,T221R,N251S,439GGT440,N306R,W376F,R522E和R570G,其中,位于DomainⅡ内的突变的活性依次是439GGT440<N306R<W376F;位于DomainⅢ内的突变R522E<R570G,二者的活性较Cry1Ca7也有明显降低;只有位于结构域Ⅰ中的R148G,产生了活性提高的突变毒蛋白,其毒性较Cry1Ca7提高了6倍,而同样位于DomainⅠ内的突变T221D<T221R<G138S<N251S,尤其是T221D活性完全丧失。研究结果表明,在结构域Ⅰ中的突变更容易产生活性提高的突变蛋白,而结构域Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白。【结论】本项研究所获得的这些活性发生不同变化的蛋白为揭示Cry蛋白的杀虫机理提供了基础材料,而活性提高的诱变基因及其表达产物将可作为新的杀虫资源,用于抗虫遗传工程菌和转基因植物的构建。

转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花(英文)

根据植物基因的结构特征,合成了CrylAc活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K。构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体。通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend )Conn LBA4404)介导转化了棉花(Gossypium hirsu-tum L.)的两个生产品种(系)。根据抗棉铃虫(Heliothis armigera )试验及农艺性状的观察调查结果,经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0％-99.7％且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个。活性CrylAc和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17％和0.09％。对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的。

抗虫棉外源Cry1A融合杀虫蛋白在土壤中的降解动态

以转Bt基因棉GK12和转Bt+CpTI基因棉中棉所41为试验材料,以其亲本材料(泗棉3号、中棉所23)为对照,采用ELISA测定方法,研究了抗虫棉外源Bt杀虫蛋白在土壤中的降解动态。结果表明:在土壤掩埋条件下,转Bt基因棉和转双价基因棉叶片中Bt杀虫蛋白的降解动态基本一致,降解周期达6个月;叶片掩埋后1～3个月,杀虫蛋白降解最迅速,4～6个月降解缓慢,第7个月已检测不到。不同生育期两者根系中Bt杀虫蛋白含量变化趋势基本一致,5月最高,6-9月迅速下降,10月至次年3月逐渐下降,至次年4月已检测不到。土壤中Bt杀虫蛋白的降解动态基本一致,两类抗虫棉播种前土壤中均检测不到Bt杀虫蛋白,苗期开始Bt杀虫蛋白的含量逐渐增加,至花期均达到最高峰,铃期以后逐渐下降。棉花收获后6个月内,两类抗虫棉田土壤中Bt杀虫蛋白含量迅速降低,到次年4月已检测不到。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究

通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析,以及与已知Cry蛋白比较,设计了6对特异性引物,通过PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上,导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性,研究结果表明含有第1～685位和含有第22～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性,与全长Cry1Ba3蛋白相比,没有改变;含有第54～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低;而含有第22～627位和含有第85～655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的活性区在第22～655位氨基酸之间。