应用滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法快速筛选克隆甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI)

根据GenBank中已知的植物细胞壁转化酶基因的保守区序列设计一对PCR引物,分别以滤纸(吸附有甜橙基因组噬茵体文库LB平板的噬菌体)和Top agarose(滤纸吸附后的LB平板)的SM洗脱液为模板,仅通过7次PCR就快速、准确、经济地筛选出CSCWI阳性克隆。提取该阳性克隆的DNA并进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过PCR方法鉴定阳性酶切条带并回收,利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和3’末端转移酶活性,改变该片段使其含有3’腺苷酸(A)突出末端,与pUCm-T载体实现了高效连接。阳性噬菌斑克隆及阳性条带的正确性得到测序的验证,表明滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法可正确和高效地应用于PCR筛选文库和亚克隆。