CSDC2蛋白免疫优势肽段分析及其多克隆抗体的制备

目的为制备含有C2的冷休克结构域(cold shock domain containing C2,CSDC2)的特异性抗体,本试验预测了CSDC2蛋白的免疫优势肽段并制备多克隆抗体,可为进一步探究其功能奠定基础。方法本研究以绒山羊CSDC2蛋白全长氨基酸序列为基础,应用在线分析工具Expasy分析亲疏水性;SOPMA和Predictprotein共同分析二级结构;DNAstar分析抗原指数、表面可及性、柔韧性;TMHHM 2.0预测跨膜结构;SWISS-MODEL预测三级结构;SignalP 5.0预测信号肽;NetPhos 3.1预测磷酸化位点;SVMTriP在线分析软件预测抗原表位,综上分析获得CSDC2免疫优势肽段,制备多克隆抗体;ELISA检测多克隆抗体效价,Western blot验证抗体特异性。结果CSDC2为不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽区域,具有22个磷酸化位点,二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链构成。最终选取绒山羊CSDC2蛋白N-端15-33氨基酸序列(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)为特异免疫肽段,诱导兔产生CSDC2蛋白特异性IgG抗体,Western blot结果表明该抗体可以与绒山羊CSDC2蛋白进行特异性结合。结论本研究得出绒山羊CSDC2的免疫优势肽段为15~33 aa(HSPKSPVWPTFPFHREGSR)并免疫试验兔制备了多克隆抗体,进一步实验证明该抗体具有较好生物学效价,为后续深入研究CSDC2在绒山羊绒毛周期性生长调控的作用奠定了理论基础。

褪黑素对绒山羊绒毛周期性生长相关基因CSDC2、FGF21、RORα表达的影响

绒山羊的绒毛生长具有周期性生长规律,埋置褪黑素可显著增加产绒量。以体外培养的绒山羊皮肤成纤维细胞为研究对象,探索褪黑素调控绒毛周期性生长的分子作用机制。采用组织块培养法培养绒山羊皮肤成纤维细胞,添加浓度为0 ng/L和500 ng/L的褪黑素处理72 h后经实时荧光定量PCR检测CSDC2、FGF21、RORα基因的表达量。结果表明,胎羊组织块自培养1 d后细胞沿边缘爬出,5 d后汇合度达80%;成年羊组织块于培养5~7 d后细胞爬出,14 d后细胞汇合度达70%,经鉴定为成纤维细胞,且胎羊成纤维细胞增殖能力更强,更适合后续功能实验的验证。经褪黑素处理后,CSDC2、FGF21表达水平显著高于对照组(P<0.05);RORα的表达量低于对照组但差异不显著(P>0.05)。说明褪黑素对绒毛周期性生长相关基因CSDC2、FGF21和RORα具有调控作用。