利用CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的B16细胞株

目的用新型CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的小鼠黑色素瘤B16细胞株,分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,并进行功能探讨。方法用微同源介导的末端连接(MMEJ)方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列插入到CSDE1基因最后一个外显子上;用流式细胞测量术、PCR、免疫荧光及活细胞成像来检测CSDE1-EGFP是否插入成功,检验EGFP的荧光强弱与CSDE1的表达高低是否一致;用Transwell小室法、小鼠荷瘤模型实验观察低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株之间的功能差异。结果分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,检测出EGFP表达强弱与CSDE1表达高低一致。观察到CSDE1蛋白表达量不同的B16细胞株在功能上有所差异。结论为研究CSDE1在其他肿瘤细胞内的动态定位以及因表达量不同而产生的功能差异,新型CRISPR/PITCH系统提供了快速有效的直观方法。

季节对民猪CSDE1表达的影响及其分子调节网络

民猪是具有抗寒特性的地方猪种,研究民猪对环境温度的适应机制对于理解其抗寒特性具有重要意义。本试验通过检测4个季节民猪外周血单核细胞中含CSD结构域的E1蛋白(cold shock domain-containing protein E1,CSDE1)、miR-1和miR-331-3p表达情况,并通过在PK15细胞中过表达CSDE1基因,检测细胞中7种干扰小RNA和8种基因,研究CSDE1在民猪环境温度适应中的作用和分子调控网络。结果表明,CSDE1在春、秋季表达量较低,而在夏、冬季表达量较高,而RNA miR-1和miR-133-3p的表达规律则相反;过表达CSDE1后细胞中小RNA miR-1、miR-101、miR-1307和基因HDAC3、BTF3、HSF2、TCEA1 mRNA的相对表达量明显上升,miR-143-3p和CHD7mRNA的相对表达量明显下降,各试验组差异显著(P<0.05)。结果表明,CSDE1的表达受到民猪所处环境温度的影响,可以被干扰小RNA调节,并进一步影响其他基因的表达。