柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。

血浆置换治疗CSHB对HMGB1和凝血炎症等指标的影响

目的观察血浆置换对慢性乙型重型肝炎(CSHB)患者肝功能、凝血指标、炎症指标、HBV-DNA、高迁移率族蛋白B(HMGB1)及终末期肝病模型(MELD)分值的影响。方法选择复旦大学附属中山医院青浦分院2017年5月-2019年10月收治的72例CSHB患者,依据治疗方式将其分为观察组(血浆置换+常规内科治疗,n=39)和对照组(常规内科治疗,n=33)。比较分析两组治疗前后肝功能、凝血指标、炎症指标、HBV-DNA、HMGB1及MELD分值,综合评价两组疗效。结果观察组总有效率(92.31%)高于对照组(72.73%),差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前两组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶原活动度(PTA)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白(FIB)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Slit2蛋白、转化生长因子-β1(TGF-β1)、HBV-DNA、HMGB1及MELD分值比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组ALT、AST、ALP、TBIL、PT、APTT、IL-6、TNF-α、TGF-β1、Slit2蛋白、HBV-DNA、HMGB1及MELD分值均降低,观察组降低幅度较对照组高,差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后两组PTA、FIB均升高,观察组升高幅度较对照组高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对慢性乙型重型肝炎患者而言,血浆置换疗法可显著改善其肝功能、凝血功能及炎症程度,并降低机体MELD分值、HBV-DNA和HMGB1浓度,疗效显著,是一种重要辅助治疗手段。

慢性乙型重型肝炎回顾性证候研究数据库的建立

目的:运用现代物理、电子信息技术、传感技术、智能化数码成像采集技术,综合中医四诊,建立慢性乙型重型肝炎回顾性证候研究数据库。方法:选择全国18家传染病院中西医结合科或综合性中医院肝病科住院病人为研究对象,通过数据库进行在线数据收集管理及分析处理。结果:制定一套规范化慢性乙型重型肝炎临床信息采集表、慢性乙型重型肝炎诊断标准、纳入标准、排除标准、病例剔出标准。结论:对复杂的临床信息进行标准化、要素化,结合慢性乙型重型肝炎的中医四诊信息及相关情况,初步形成了慢性乙型重型肝炎回顾性证候研究数据信息平台,为慢性乙型重型肝炎病人的诊治和科研顺利开展提供信息方面的保障。