牦牛CST3基因的克隆、表达及生物信息学分析

CST3基因又名半胱氨酸蛋白酶抑制剂3,其翻译的蛋白质作用是抑制半胱氨酸蛋白酶。为研究牦牛附睾精子成熟相关机理,本研究克隆了牦牛CST3基因并进行生物信息学分析,测定其在附睾不同区域(头、体和尾)的表达。结果显示:CST3基因的编码区全长为447 bp;CST3蛋白的分子量为16.26 ku,等电点为9.23,弱碱性蛋白,存在信号肽序列;CST3蛋白序列长度为148个氨基酸,存在一个跨膜区,表达于细胞质和分泌;CST3基因在附睾头体尾均有表达,且头部的表达量远高于体部和尾部(P<0.05)。本研究结论为牦牛CST3基因的理论研究提供了相关依据。

长爪沙鼠CST3序列同源性分析及蛋白体外表达

目的分析长爪沙鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C,CST3)cDNA序列同源性,并建立CST3蛋白原核表达体系,为长爪沙鼠CST3抗体制备和后续基因功能研究奠定基础。方法对长爪沙鼠Cst3 cDNA序列进行克隆、同源性分析及密码子优化;将优化后序列酶切连接到pET28a载体,完成重组CST3蛋白表达载体构建;将该载体转化到感受态细胞中,通过异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导实现CST3蛋白的原核表达,并用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证。结果长爪沙鼠Cst3基因与人和小鼠Cst3基因的序列同源性较低。密码子优化后的长爪沙鼠Cst3表达序列插入到pET28a质粒中,获得了CST3蛋白表达载体。经1 mmol/L IPTG 37℃诱导12 h,可获得大量CST3蛋白。结论成功地构建了长爪沙鼠CST3蛋白的体外表达体系。

巢式PCR-RFLP法检测Cystatin C基因多态性的实验研究

目的建立检测高GC含量的CST3基因多态性的巢式PCR-RFLP方法.方法以巢氏PCR方法扩增CST3基因5′端和外显子1的特异性片段,用RFLP方法分析该基因的多态性.结果应用Enhancer System,以巢氏PCR方法能高效扩增出高GC含量的CST3基因5′端和外显子1区的特异性片段,用SacⅡ限制性酶切对CST3基因多态性进行有效分析.结论该方法能准确、高效的对CST3基因多态性进行分析,研究结果对高GC含量基因的研究有借鉴价值.