基于IL-6/STAT3信号通路探讨山楂酸对小鼠结肠癌CT26细胞增殖、凋亡的影响

目的从IL-6/STAT3信号通路探讨山楂酸(MA)对小鼠结肠癌CT26细胞增殖、凋亡的影响。方法体外培养CT26细胞,设置空白组、10、20、30、35、40μmoL·L^(-1)MA组。干预24 h后,采用CCK-8法检测山楂酸对细胞活力的影响,采用RT-PCR检测IL-6 mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用Western blotting检测各组细胞中STAT3通路相关蛋白的表达水平。设置空白组、IL-6(20 ng·μL^(-1))刺激组、不同浓度MA与IL-6共刺激组,采用Western blotting检测各组细胞p-STAT3、STAT3蛋白的表达水平。设置空白组、MA组、磷酸酶抑制剂(正钒酸钠)组和MA+正钒酸钠组,采用Western blotting检测各组细胞p-STAT3、STAT3蛋白的表达水平。结果与空白组相比,CCK-8结果显示20、30、35、40、45、50μmoL·L^(-1)浓度的山楂酸均能降低CT26细胞活力(P<0.05),IC50=37.32μmoL·L^(-1);RT-PCR结果显示30、35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞中IL-6 mRNA水平下降(P<0.05);流式细胞术结果显示30、35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞凋亡率增加(P<0.05);Western blotting结果显示35、40μmoL·L^(-1)给药组细胞中STAT3通路相关蛋白p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05),MA+正钒酸钠组能恢复MA单独给药组中被降低的p-STAT3蛋白水平(P<0.05)。结论MA可能通过降低IL-6的表达水平,抑制STAT3的磷酸化,从而降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制其增殖。

cRGD修饰负载锌的枝状介孔硅载体递送双硫仑靶向杀伤结直肠癌CT26细胞

目的:制备一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽(cRGD)修饰、Zn^(2+)掺杂并负载双硫仑(DSF)的树枝状介孔硅纳米颗粒,初步研究其对结直肠癌CT26细胞的靶向杀伤作用。方法:采用水热合成法将Zn^(2+)锚定在树枝状介孔硅纳米颗粒的骨架中,再将DSF负载在介孔孔道中,偶联靶向配体cRGD到纳米颗粒的表面,得到具有靶向功能的纳米颗粒DSF@Zn-DMSN-cRGD。采用透射电镜(TEM)检测DSF@Zn-DMSN-cRGD的表面形貌,通过能谱面扫得到元素映射图验证其中的元素分布,通过激光粒度仪检测其粒径与电位变化,使用红外光谱仪检测表面主要化学键。通过TEM观察载体Zn-DMSN在pH6.5和pH7.4的模拟体液中共培养后的形态,采用细胞摄取实验检测cRGD修饰的Zn-DMSN靶向CT26细胞的能力,采用CCK-8法、Calcein-AM/PI染色法和流式细胞术检测DSF@Zn-DMSN-cRGD对CT26细胞的杀伤能力及对细胞凋亡的影响。结果:TEM观察表明DSF@ZnDMSN-cRGD表面具有多孔径,元素映射结果显示Zn元素和DSF成功负载在纳米颗粒表面,红外光谱仪检测结果表明cRGD成功偶联在DSF@Zn-DMSN介孔硅复合载体的表面,电位粒径结果显示粒径较未偶联cRGD前稍大,电位明显增加(P<0.000 1),TEM观察发现Zn-DMSN在微酸性环境中其骨架崩解明显增多,细胞摄取实验结果表明经cRGD修饰后的Zn-DMSN被CT26细胞内吞的效率显著增加(P<0.05)。CCK-8法、Calcein-AM/PI染色法和流式细胞术检测结果说明DSF@Zn-DMSN-cRGD能够高效杀伤CT26细胞(均P<0.000 1)并诱导细胞发生凋亡(均P<0.000 1),而对正常地肠上皮细胞NCM460无明显损伤。结论:成功合成了一种掺杂锌、负载DSF并偶联cRGD的纳米颗粒DSF@Zn-DMSN-cRGD,其载体Zn-DMSN骨架具有良好的pH降解性,其中的c RGD能促进纳米颗粒被CT26细胞靶向内吞;在体外实验中,Zn-DMSN-cRGD能够对结直肠癌CT26细胞产生强烈的靶向细胞毒性。

肠瘤康对结肠癌CT26细胞的影响及调控机制研究

目的:研究中药肠瘤康对体外和体内小鼠结肠癌CT26细胞的影响,探讨其调控机制。方法:使用不同质量分数(0、0.1、10、100 mg/L)肠瘤康提取液干预小鼠体外和体内结肠癌CT26细胞,采用细胞增殖检测法、流式细胞术、细胞侵袭及细胞迁移检测CT26细胞的增殖、侵袭与迁移能力,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹试验检测CT26细胞中CDK4、p21、p27的表达。结果:不同质量分数的肠瘤康对CT26细胞增殖抑制率不同,随着给药剂量和时间的增加,增殖抑制率呈上升趋势,CT26细胞的增殖的呈现时间-剂量依赖性(P<0.05),且对侵袭与迁移能力抑制显著(P<0.01)。反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法结果显示,CDK4的mRNA和蛋白表达水平均呈下降趋势,而p21和p27的蛋白表达水平呈上调趋势。结论:肠瘤康通过下调CDK4、上调p21和p27的表达来抑制CT26细胞的增殖。

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响

目的探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠T淋巴细胞增殖及活性的影响。方法 (1)取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡肿瘤细胞及坏死肿瘤细胞,取Balb/c小鼠脾脏分离T淋巴细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。(2)将凋亡肿瘤细胞、坏死肿瘤细胞、正常肿瘤细胞分别与小鼠CTL共同培养(分别为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组),测定CTL的活性及增殖情况。(3)将小鼠T淋巴细胞分为对照组、刀豆蛋白A(Con A)组、凋亡肿瘤细胞+Con A组、坏死肿瘤细胞+Con A组、活肿瘤细胞+Con A组,经相应处理后测定各组T淋巴细胞的活性及增殖情况。(4)选取30只Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞通过皮下及静脉输注小鼠,检测各组小鼠血清调节性T细胞(Treg)的表达情况。(5)另取30只小鼠,按方法(4)分组及处理后,测定各组小鼠血清可溶性Fas(s Fas)、白细胞介素(IL)-12、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果凋亡肿瘤细胞组中CTL的活性、A450值均低于其他两组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞+Con A组的T淋巴细胞CD69、CD25、CD71的表达率以及G2、G3及G4期的T淋巴细胞数量均低于Con A组、活肿瘤细胞+Con A及坏死肿瘤细胞+Con A(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组Treg的表达水平、s Fas相对表达量低于肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组IL-10、TGF-β表达水平高于其他两组(P<0.05),而IL-12表达水平均低于其他两组(P<0.05),IL-4表达水平则高于肿瘤细胞对照组(P<0.05)。结论凋亡小鼠大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠T淋巴细胞增殖及活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能。

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响

目的探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响。方法取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡、坏死肿瘤细胞。取Balb/c小鼠20只,分离T淋巴细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞、获取巨噬细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。将小鼠CTL、NK细胞、巨噬细胞分别经相应肿瘤细胞处理后,均分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组,应用51Cr释放实验测定各组CTL、NK细胞、巨噬细胞的活性,细胞计数(CCK-8)法检测各组CTL、NK细胞和巨噬细胞的增殖情况。另选取Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞按通过皮下及静脉输注小鼠,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清可溶性Fas(s Fas)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-12、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果与坏死肿瘤细胞组及肿瘤细胞对照组比较,凋亡肿瘤细胞组中不同效靶比的CTL、NK细胞及巨噬细胞活性均降低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,凋亡肿瘤细胞组的CTL、NK细胞及巨噬细胞的A450值均低于坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组(P<0.05)。ELISA检测显示凋亡肿瘤细胞组s Fas相对表达量低于坏死肿瘤细胞组和肿瘤细胞对照组(P<0.05)。凋亡肿瘤细胞组IL-4表达水平高于肿瘤细胞对照组(P<0.05),IL-10、TGF-β表达水平则高于其他两组(P<0.05),IL-12表达水平低于其他两组(P<0.05)。结论凋亡大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠特异性CTL、NK细胞、巨噬细胞增殖及其活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能。

hMIP-1β基因转染小鼠结肠腺癌CT26细胞对免疫细胞的体内外趋化作用

探讨转染人巨噬细胞炎性蛋白1β(human macrophage inflammatory protein-1 beta,hMIP-1β)基因的小鼠结肠腺癌CT26细胞的生物学特性、致瘤性及对免疫细胞的体内外趋化作用。利用重组腺病毒载体携带hMIP-1β基因(AdhMIP-1β)转染CT26细胞。X-gal染色法检测基因转染效率;ELISA法检测基因转染CT26细胞培养上清中hMIP-1β的含量;Boyden趋化小室法检测培养上清对CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞及未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)的趋化作用。小鼠皮下接种转染hMIP-1β基因的CT26细胞,观察其体内致瘤性和对免疫细胞的趋化作用。结果显示,腺病毒载体可携带hMIP-1β基因转染CT26细胞并高效表达hMIP-1β(P<0.01),培养上清含hMIP-1β且对免疫细胞有明显趋化作用。转染hMIP-1β基因的CT26细胞皮下接种后成瘤率降低,肿瘤生长速度减慢,肿瘤内可见明显坏死灶,坏死灶内和周围可见较多淋巴细胞浸润。提示hMIP-1β基因转染CT26细胞后,通过分泌hMIP-1β趋化淋巴细胞等免疫细胞到肿瘤局部发挥有效的抗肿瘤作用,从而为肿瘤的免疫治疗提供新的思路和策略。

ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制

目的探讨ART1基因的表达对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能作用机制。方法将ART1-sh RNA转入到小鼠结肠癌CT26细胞,置于荧光显微镜下观察该病毒的转染效率;采用RT-PCR和Western印迹法鉴定ART1基因沉默的效果;采用侵袭实验及黏附实验观察CT26细胞受ART1基因沉默的影响,并采用明胶酶谱法测定对该细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白活性的影响。结果病毒感染4 d后ART1 m RNA的表达量在ART1-sh RNA组中明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞的ART1蛋白的表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。ART1-sh RNA组CT26细胞数明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);ART1-sh RNA组的侵袭抑制率与阴性对照组和空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组和空白对照组相比,RT1-sh RNA组CT26细胞与纤维连接蛋白的黏附能力均明显降低(P<0.01)。RT1-sh RNA组CT26细胞中Rho A/Rho相关螺旋卷曲形成蛋白激酶(ROCK1)、Rho A、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。结论 ART1基因沉默能够导致小鼠结肠癌CT26细胞的侵袭和黏附力降低,可能与ART1基因沉默后ROCK1、Rho A、MMP-2、MMP-9的表达水平下调有关。说明ART1基因在结肠癌的侵袭和转移中具有重要作用。

复方肠泰方通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路诱导CT26细胞自噬的研究

目的:研究复方肠泰方对结肠癌CT26细胞增殖和自噬的影响及其可能的作用机制。方法:采用MTT法检测不同浓度复方肠泰方对CT26细胞增殖的影响,MDC染色法和透射电镜观察复方肠泰方干预CT26细胞后是否形成自噬体。蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的蛋白表达。采用自噬诱导剂雷帕霉素研究复方肠泰方是否诱导CT26细胞自噬性死亡。采用蛋白质印迹法检测Akt/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达水平。结果:复方肠泰方可以抑制CT26细胞的增殖;透射电镜观察到复方肠泰方干预的细胞中有类似自噬溶酶体结构;MDC结果显示,与空白对照组相比,复方肠泰方组细胞荧光强度增强;复方肠泰方能增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的表达水平(P<0.05);与复方肠泰方组相比,复方肠泰方和雷帕霉素共同处理使CT26细胞的病死率显著增加(P<0.05);此外,复方肠泰方干预后,CT26细胞Akt、mTOR和p70S6K的蛋白表达基本不变,p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K的蛋白表达较空白对照组显著降低(P<0.05)。结论:复方肠泰方可能通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路诱导结肠癌CT26细胞自噬,从而发挥抗肿瘤作用。

MLL5基因敲除对小鼠结肠癌CT26细胞移植瘤生长的影响及其机制

目的:探讨混合谱系白血病5(MLL5)基因在小鼠结肠癌CT26细胞移植瘤生长中的作用及其分子机制。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建MLL5基因缺失、MLL5和DDX58双基因缺失的结肠癌CT26细胞模型,用Sanger测序和WB法验证敲除效果。将基因敲除的CT26细胞接种到野生型BALB/c小鼠和免疫缺陷型NSG小鼠皮下,构建基因缺失结肠癌CT26细胞移植瘤小鼠模型,并观察移植瘤的生长及荷瘤小鼠的总生存期(OS)。结果:在野生型小鼠中,MLL5基因缺失的CT26细胞移植瘤生长速度显著性低于野生型癌细胞移植瘤,并延长荷瘤小鼠的OS(P<0.01);在NSG小鼠中,MLL5基因缺失对CT26细胞移植瘤的生长速度以及荷瘤小鼠的OS没有明显改变。MLL5基因缺失提高了癌细胞中视黄酸诱导基因1(RIG-1)蛋白水平,DDX58基因缺失可逆转MLL5基因缺失在CT26细胞移植瘤中的作用。结论:MLL5基因缺失可提高结肠癌CT26细胞中RIG-1蛋白水平、促进肿瘤免疫,从而抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,提示MLL5可能成为结肠癌治疗的新靶点。

不同pH对结肠癌CT26细胞生物力学特性的影响

目的:研究不同pH环境对结肠癌CT26细胞生物力学特性的影响。方法:将CT26分为pH6.5、pH7.3(对照组)和pH7.8组,分别加入pH6.5、pH7.3与pH7.8条件培养基处理24 h,采用CCK8试剂盒检测各组CT26的细胞活力、电泳迁移率(EPM)实验计算EPM,用以检测细胞膜的负电荷量、荧光偏振法计算细胞荧光偏振度(P),以检测细胞膜的流动性、激光共聚焦显微镜检测丝状肌动蛋白(F-actin)表达。结果:与pH7.3组比较,pH6.5与pH7.8组中CT26活力变化不明显(P>0.05);与pH7.3组比较,pH7.8组CT26的EPM明显减少、P值增加,F-actin表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:pH环境对肿瘤细胞的影响可能与pH值影响肿瘤细胞表面的负电荷、膜流动性及细胞中F-actin表达有关。

NaCl对结肠癌CT26细胞迁移能力和生物力学特性的影响

目的:研究NaCl对结肠癌CT26细胞迁移能力和生物力学特性的影响。方法:将CT26分为0、10、20和40 mmol/L NaCl处理组,分别用相应浓度NaCl条件培养基处理24 h,利用CCK8试剂盒检测细胞活力;以0及20 mmol/L NaCl处理24 h的CT26分别作为对照组和NaCl处理组,划痕实验观察CT26的迁移能力、荧光偏振法检测细胞膜流动性、电泳迁移率实验检测细胞膜负电荷量、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白丝状肌动蛋白(F-actin)结构。结果:20 mmol/L NaCl处理CT26细胞24 h对其活力无影响(P>0.05);与对照组相比,20 mmol/L NaCl处理能显著抑制CT26的迁移能力(P<0.05)、细胞膜流动性(P<0.05)、膜负电荷量(P<0.05)和F-actin的表达(P<0.05)。结论:20 mmol/L NaCl能显著影响结肠癌CT26细胞的迁移能力细胞膜流动性、膜负电荷量和F-actin表达等生物力学特性。

稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系的构建及鉴定

实体瘤缺乏明确的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T)治疗靶点。因此,通过慢病毒将已经明确的靶点分子CD19带入实体瘤细胞系,研究CD19 CAR-T细胞对其的杀伤,能够为CAR-T细胞针对实体瘤的治疗提供潜在的支撑。本研究利用三质粒慢病毒系统构建了稳定表达CD19、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FLUC)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的结肠癌CT26细胞系CT26-CD19-FLUC-GFP。该细胞系与CT26细胞系的生长活性一致。通过流式细胞术检测不同代次CT26-CD19-FLUC-GFP细胞,证实了CT26-CD19-FLUC-GFP细胞连续传代至第5、10、22代后CD19及GFP的稳定表达。进一步证实,连续传代至第22代的CT26-CD19-FLUC-GFP细胞中的CD19 mRNA及FLUC表达水平显著高于对照组CT26细胞。与T细胞相比,CD19CAR-T细胞能够显著杀伤CT26-CD19-FLUC-GFP细胞及MC38-CD19细胞。CT26-CD19-FLUC-GFP细胞腹腔植入小鼠体内1周后,通过活体成像仪可以检测到腹腔区域的FLUC表达。上述结果表明,成功构建了稳定表达CD19-FLUC-GFP的CT26细胞系,且该细胞系能够被CD19 CAR-T细胞特异性杀伤。

刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌细胞ct26体外增殖和细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖和细胞周期的影响,并探讨其作用的分子机制。方法取对数生长期的小鼠结肠癌ct26细胞,建立弓形虫与ct26复合感染度(moi)分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的共培养试验模型,台盼兰排斥试验连续7d绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测8∶1共培养模型组6h、12h、24h、48h细胞周期改变;采用半定量RT-PCR方法分别检测ct26细胞cyclinB1、cdc2基因转录水平变化;Westernblot方法检测细胞周期蛋白cyclinB1蛋白水平变化。结果台盼兰排斥试验发现各比例组弓形虫均能有效抑制小鼠ct26细胞的体外增殖,且呈现前4d缓慢抑制,4d后细胞大量死亡的现象,以8∶1模型组的增殖抑制作用最明显,感染7d后细胞抑制率达80.77%(P<0.01);流式细胞仪检测发现8∶1模型组弓形虫可在各作用时间明显改变ct26细胞周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P<0.01),24h达到作用高峰,使G2/M期百分比升高12.77%,48h则细胞G2/M期百分比下降;弓形虫感染ct26细胞3～24h,细胞cdc2转录水平在各个时间点未见明显变化,细胞cyclinB1从转录水平和蛋白水平均呈现为感染3h时表达增强,随后各时间点均明显降低的现象,cyclinB1基因转录水平在感染后24h只达到对照组的16.55%。结论弓形虫RH株速殖子可明显抑制小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖,感染前期以诱导细胞发生G2/M期阻滞为主要机制,细胞周期蛋白cyclinB1活性下降在G2/M期阻滞中起主要作用。

刚地弓形虫RH株速殖子协同VP-16体外杀伤小鼠结肠癌细胞ct26的作用

目的探讨刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞周期的影响及其协同细胞周期特异性抗癌药依托泊甙(VP-16)对ct26细胞的杀伤作用。方法建立弓形虫RH株速殖子与小鼠结肠癌ct26细胞不同比例的共培养模型(虫/细胞比例分别为2:1、4:1、8:1、16:1),流式细胞仪检测24h细胞周期改变;以虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h,CCK-8比色法观察不同浓度VP-16对细胞增殖抑制的改变;荧光显微镜观察VP-16(40μg/mL)对感染虫体细胞的形态学改变。台盼蓝染色观察不同浓度VP-16分别作用弓形虫RH株速殖子悬液(1×106/mL)2h、4h、12h、24h的虫体存活度改变。琼脂糖凝胶电泳观察VP-16(20μg/mL)对虫体DNA影响。结果流式细胞仪检测发现各浓度弓形虫速殖子均可明显改变ct26细胞24h周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P<0.01)。2×106个速殖子感染细胞24h可使S期和G2期细胞百分比共同增长14.92%。CCK-8比色法检测结果显示虫细胞比例2:1预先感染ct26细胞24h可有效增强各浓度VP-16对ct26细胞的杀伤作用;Hochest33258染色结合荧光显微镜观察到虫体胞质寄生形态及VP-16诱导感染细胞凋亡典型形态;10μg/mL及更高浓度VP-16作用弓形虫4h以上均可使虫体全部死亡;琼脂糖凝胶电泳发现VP-16(20μg/mL)可使弓形虫速殖子DNA呈现典型的云梯状条带。结论弓形虫RH株速殖子可使小鼠结肠癌ct26细胞发生G2/M期,可有效增强细胞周期特异性抗癌药VP-16的抗癌作用,且弓形虫增殖亦明显受抑并发生凋亡。

RPS20 RNA干扰慢病毒的构建及其对CT26细胞生长的影响

目的研究脾虚证差异表达基因——核糖体蛋白S20(RPS20)RNA干扰慢病毒转染对小鼠结肠癌细胞(CT26)细胞指数的影响,验证前期筛选的RNA干扰序列的有效性,为后续在小鼠体内以RNA干扰进行RPS20的功能鉴定提供参考。方法根据前期筛选的RPS20 RNA干扰有效序列,进行质粒载体的重组,包装RPS20干扰慢病毒并转染CT26细胞,采用xCELLigence细胞动态分析仪实时监测转染后细胞的细胞指数以反映细胞的生长情况。结果测序图谱和Blast比对结果表明重组慢病毒包装载体构建成功,慢病毒滴度为1.2×105TU/mL,RNA干扰慢病毒转染后CT26细胞指数的增长受到明显抑制,转染后30 h细胞指数抑制率达到82.24%。结论前期筛选的RPS20 RNA干扰序列可成功构建包装干扰慢病毒,转染后能有效抑制CT26细胞的生长,可为后续研究提供参考。

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及作用机制的研究

目的:通过沉默精氨酸特异性单-ADP-核糖基化作用转移酶-1(arginine-specic mono-ADP-ribosytransferase-1,ART1)基因的表达,探讨其对小鼠结肠癌CT26细胞转移潜能的影响及可能的作用机制。方法:采用慢病毒转染系统将特异性针对ART1基因的ART1-shRNA转入结肠癌CT26细胞中,在荧光显微镜下观察转染效率;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法鉴定ART1基因沉默的效果;采用Transwell小室侵袭实验和黏附实验观察ART1基因沉默对CT26细胞侵袭及黏附能力的影响;明胶酶谱法测定ART1基因沉默对CT26细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metall oproteinase-2,MMP-2)及MMP-9蛋白活性的影响;蛋白质印迹法检测对ART1、RhoA(Ras homolog gene family,member A)、ROCK1(Rho-associated coiled-coil contanining kinase 1)、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响。结果:成功获得了ART1基因沉默的稳定细胞株;ART1-shRNA转染组CT26细胞的侵袭及黏附抑制率分别为39.63%和40.70%,与空白对照组相比,ART1基因沉默后CT26细胞侵袭和黏附能力降低(P<0.05);MMP-2和MMP-9蛋白的活性降低,RhoA、ROCK1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达量均被下调(P<0.05)。结论:ART1基因沉默可降低CT26细胞的侵袭和黏附能力,可能与ART1基因沉默后下调RhoA、ROCK1、MMP-2和MMP-9的表达以及MMP-2和MMP-9蛋白的活性有关,提示ART1基因在结肠癌侵袭和转移中发挥重要的作用。

重组艰难梭菌毒素B对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用

本文探讨了重组艰难梭菌毒素B(rTcdB)对小鼠结肠癌CT26细胞的诱导凋亡作用。采用不同浓度rTcdB处理CT26细胞,通过MTT法检测细胞增殖抑制率;比色法测定Caspase3活性;细胞形态学和流式细胞技术检测细胞凋亡。结果表明,rTcdB显著抑制了CT26细胞的增殖,并呈时间-剂量依赖性;Caspase3活性在处理6h后显著升高,至18h达到最大值,与对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05);荧光显微镜观察到典型细胞凋亡形态学变化,细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)异位到了膜外侧,细胞膜呈明亮的绿色荧光;通过流式细胞仪检测结果表明,细胞凋亡率呈时间-剂量依赖性增加。实验结果表明,重组艰难梭菌毒素B能够诱导小鼠结肠癌CT26细胞凋亡。

高压氧对小鼠CT26结肠腺癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

目的探讨高压氧(HBO)对小鼠CT26结肠癌细胞周期和荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法应用流式细胞仪检测对照组和HBO组CT26癌细胞的细胞周期;建立小鼠结肠癌移植瘤模型,观察0.2MPaHBO对CT26癌细胞移植瘤生长的影响。结果对照组细胞在G0G1期、S期、G2M期的比例分别为74.82%、20.38%、4.80%;而HBO后12h组为66.48%、33.16%、0.36%,HBO后24h组为55.89%、40.79%、3.32%。HBO组小鼠肿瘤的体积和重量较模型对照组降低,肿瘤体积抑制率为32.39%,重量抑制率为35.77%。结论HBO可使CT26细胞在S期积蓄,并抑制荷瘤小鼠移植瘤的生长。

大黄素对小鼠结肠癌CT26.WT细胞的抑制作用

目的探讨大黄素对小鼠结肠癌细胞CT26.WT的抑制作用。方法 MTT法检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT增殖的抑制作用;细胞划痕实验检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT迁徙的抑制作用;流式细胞仪检测大黄素对结肠癌细胞CT26.WT表达CC族趋化因子受体4(CCR4)和叉头蛋白3(Foxp3)的影响。结果大黄素明显抑制CT26.WT细胞的增殖,加入的大黄素浓度越高抑制效果越好(P<0.05);大黄素抑制CT26.WT细胞的迁徙,抑制效果随浓度升高而愈加明显(P<0.01);大黄素抑制CT26.WT细胞的Foxp3表达,而表达CCR4的肿瘤细胞的比例同样低于不加药组,这种抑制作用与大黄素的药物浓度呈负相关(P<0.01)。结论大黄素抑制小鼠结肠癌的CT26.WT细胞增殖,Foxp3和CCR4在CT26.WT细胞的表达降低,可能是大黄素抑制其迁徙的原故。