多功能转录因子CTCF结构域的转录活性研究

目的:CTCF是广泛存在于真核生物中的多功能转录因子。利用细胞瞬时表达实验在HeLa细胞系中研究CTCF各结构域的转录活性。方法:借用CheckMate哺乳动物双杂交系统的2个质粒pBIND和pG5LUC,将CTCF的N、M、C段及全长编码序列克隆至pBIND质粒的GAL4DNA结合结构域编码序列后的多克隆位点,将表达GAL4DNA结合结构域-CTCF融合蛋白的pBIND重组质粒与由腺病毒晚期主要启动子控制的报告基因质粒pG5LUC共转染HeLa细胞系,检测CTCF各结构域对报告基因表达水平的影响。结果:转染含CTCFN段的质粒可使报告基因的表达量增长至3.5倍以上;转染含CTCF其他片段的质粒对报告基因的表达没有明显的影响。结论:在HeLa细胞中,对启动子具有转录激活活性的主要是CTCF的N段,而M段和C段几乎没有转录激活活性。

多功能转录因子——阴阳因子-1研究进展

真核基因的表达受到顺式作用元件和反式作用因子的调控。阴阳因子－１（ＹｉｎＹａｎｇ－１，ＹＹ１）是一类新的反式作用因子的代表，它具有转录激活功能、转录阻遏功能，可作为一个起始子结合蛋白因子，同时它又是核基质结合蛋白，阴阳因子－１可与其他蛋白发生作用，其结合基序的多样性可能是其功能多样性的基础，据信，阴阳因子－１可以通过多种机制发挥作用。

MEF2心血管疾病相关的多功能转录因子

1989年0lson及其同事鉴定了骨骼肌管核内的一种蛋白质,为MCK基因启动子的重要组成部分,属于MADS超家族成员,具有与DNA结合的特性,这就是肌细胞增强因子-2（MEF2）转录因子。

湖羊转录因子CTCF基因序列分析及其对NR5A1基因转录活性的调控

转录因子CTCF在动物生长发育过程中发挥重要的调控作用,但其在绵羊中的序列特征、组织器官表达及功能目前尚不清楚。本研究以湖羊CTCF基因为研究对象,采用PCR方法克隆获得其编码区全序列,发现其序列全长2187 bp,编码727个氨基酸残基,含有11个连续的锌指结构域。组织器官表达谱分析发现CTCF基因在湖羊各个组织器官中广泛表达,在子宫中表达量相对较低,在胃中表达量相对较高。JASPAR在线软件预测发现核受体NR5A1基因内含子(翻译起始位点ATG前393 bp片段)含有3个CTCF结合位点,双荧光素酶试验结果显示,CTCF结合位点突变后NR5A1基因转录活性显著或极显著下降,表明CTCF可能通过调控NR5A1基因转录参与调控湖羊繁殖性能。

CTCF调控小鼠AML12肝细胞系脂质代谢功能与基因表达

目的·明确CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)对肝细胞脂质代谢的调控作用,并探究CTCF调控肝细胞基因表达的作用机制。方法·通过慢病毒将稳定表达Ctcf shRNA的DNA序列整合到小鼠永生化的AML12肝细胞系中,实现对Ctcf的稳定敲低。通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)验证Ctcf的敲低效率。碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色测定细胞周期,使用CCK-8法绘制细胞生长曲线,检测Ctcf敲低对细胞生长的影响。油红O染色标记细胞内脂质,检测CTCF对AML12细胞脂质代谢和脂滴累积的影响。使用CUT&Tag测序技术分析Ctcf敲低后CTCF在全基因组的结合变化。结合RNA测序(RNA-seq)的转录组数据分析CTCF结合变化后的转录组变化,使用基因本体论(GO)、京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析及基因集富集分析(GSEA)揭示Ctcf敲低对AML12肝细胞基因的表达影响,并探究差异基因与CTCF结合变化间的关联。结果·RT-qPCR结果表明Ctcf在mRNA水平敲低了63.4%,Western blotting验证了CTCF在蛋白表达层面降低了57.7%(均P<0.05)。生长曲线及周期实验确定了Ctcf敲低后细胞增殖阻滞于G1/G0期。并且AML12细胞在Ctcf敲低后自发出现细胞内脂质蓄积(P<0.05)。CTCF在全基因组的结合呈现出显著变化,大多数CTCF结合差异区域表现出CTCF结合减少,但仍有部分区域CTCF结合增加。转录组数据显示Ctcf敲低导致1344个基因出现显著的表达变化,在上调基因中富集出与脂滴堆积相关的脂质代谢通路。CTCF结合上调峰关联的差异基因富集在脂质转运与脂质定位相关通路,而CTCF结合下调峰关联的差异基因主要富集在DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞周期等生物学过程,但CTCF在基因组的结合变化并不足以导致邻近基因的表达上调或下调。结论·CTCF通过调控脂质代谢相关基因的表达影响肝细胞的代谢功能,然而CTCF在基因组上的结合变化与邻近基因的表达缺乏显著的相关性,可能主要通过远端调控的方式对基因表达产生影响。

转录因子CTCF抑制pro-B细胞中Igκ基因的重排

目的:研究CCCTC位点结合蛋白(CTCF)对Igκ基因重排的影响。方法:采用RNA干扰技术特异性地下调CTCF的表达,然后利用脂多糖(LPS)诱导祖B细胞(pro-B cell)38B9的分化。利用PCR来定量分析不同的Vκ基因hf24和Vκ21G的重排情况。结果:CTCF在38B9细胞中表达下调后hf24和Vκ21G的重排都有所上升。结论:在pro-B细胞中CTCF对Igκ基因的重排起抑制作用。

转录因子CTCF在肿瘤发展中的调控机制研究进展

CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)是一种高度保守的多功能转录因子,含有11-锌指结构,可与DNA、蛋白质和RNA相互作用,参与基因的表达调控。CTCF可通过基因DNA甲基化水平的改变、基因突变、CTCF/Cohesin复合体、BORIS/CTCF系统调控CTCF的功能,参与肿瘤的发生和发展。该文就转录因子CTCF在肿瘤发展中的调控机制作一综述。

合浦珠母贝iPS细胞相关的转录因子的克隆及分析

转录因子Sox2、Oct4、c-Myc和KLF4在iPS细胞研究中具有重要作用,将它们加入体外培养的细胞中,可以诱导体细胞去分化成为多能干细胞。作者通过RACE-PCR技术从合浦珠母贝(Pinctada fucata)的外套膜组织中克隆获得了3个转录因子——c-Myc、Sox2及KLF4的cDNA。c-Myc全长1585bp,开放阅读框的长度为1131bp,编码376个氨基酸,蛋白结构分析表明它具有保守的HLH和Myc-N结构域。Sox2全长1908bp,开放阅读框长度为990bp,编码329个氨基酸,蛋白结构分析它具有保守的HMG-box和Soxp结构域。KLF4全长2268bp,开放阅读框长624bp,编码207个氨基酸,预测该蛋白具有两个zf-H2C2_2结构域。BLAST分析它们均与太平洋牡蛎的相关蛋白具有较高同源性,说明其与太平洋牡蛎亲缘关系更近。RT-PCR实验发现这3个基因在合浦珠母贝外套膜、足、生殖腺、内脏团、闭壳肌和鳃6种组织中均有表达,表明它们是非常保守的转录因子。本研究对于合浦珠母贝细胞系建立和研究具有启发意义。

美科学家新方法提高多功能干细胞安全性

据《自然·生物技术》杂志网络版报道，美国加利福尼亚大学旧金山分校科学家利用微RNA小分子取代一种可能致癌的转录因子，成功将实验鼠皮肤细胞转化为“诱导多功能干细胞（iPS细胞）”。

猪多功能转录因子CTCF重组质粒构建及鉴定

CTCF蛋白可以通过与H19印记控制区域（ICR）、差异甲基化区域-1（DMR1）以及基质附着区域-3（MAR3）发生结合,从而起到对胰岛素样生长因子-2（IGF-2）的抑制作用。本实验从猪胎儿细胞中提取总RNA并进行RT-PCR,成功克隆出全长为2.2kb的猪CTCF基因（GeneBank序列号:NM001244660.1）。经NheI和EcoRI双酶切鉴定和测序比对后。

原钙粘蛋白基因簇调控区域中成簇的CTCF结合位点分析

哺乳动物中原钙粘蛋白(Protocadherin,Pcdh)基因簇包含50多个串联排列的基因,这些基因形成3个紧密相连的基因簇(Pcdh?、Pcdh?和Pcdh?),所编码的原钙粘蛋白质群在神经元多样性(Neuronal diversity)和单细胞特异性(Single cell identity)以及神经突触信号转导中发挥重要作用。前期的工作已证实转录因子CTCF(CCCTC-binding factor)与CTCF结合位点(CTCF-binding site,CBS)的方向性结合能够决定增强子和启动子环化的方向以及其远距离交互作用的特异性,并进一步在Pcdh基因座(Locus)形成两个(Pcdh?和Pcdh?)染色质拓扑结构域(CTCF/cohesin-mediated chromatin domain,CCD),而且染色质拓扑结构域对于控制基因表达调控至关重要。本文通过生物信息学方法对比人类和小鼠序列,发现Pcdh??染色质拓扑结构域调控区域中的DNase I超敏位点(DNase I hypersensitive sites,HSs)较为保守。染色质免疫沉淀及大规模测序实验(Chromatin immunoprecipitation and massive parallel sequencing,Ch IP-Seq)揭示CBS位点在Pcdh??调控区域中成簇分布并且具有相同的方向。凝胶电泳迁移实验(Electrophoresis mobility shift assay,EMSA)确定Pcdh??调控区域内具体的42 bp CBS位点并且发现一个CTCF峰包含两个CBS位点。在全基因组范围内,运用计算生物学方法分析CTCF和增强子、启动子等调控元件的关系,发现CBS位点在调控元件附近有较多分布,推测CTCF通过介导增强子和启动子的特异性交互作用,在细胞核三维基因组内形成活性转录枢纽调控基因精准表达。

核因子-κB抑制剂及其在肺部疾病中的应用

核因子-κB(NF-κB)是一个多功能核转录因子,能在基因转录水平调控多种炎症因子的表达,与肺部炎症疾病关系密切。人们研究发现体内外多种物质可抑制NF-κB的活性,这些NF-κB抑制剂通过不同的机制抑制其活化,从而阻断炎症因子的生成。探索新的NF-κB抑制剂,进一步研究其临床应用价值,必将对炎症疾病的治疗带来新的契机。

利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。

原代培养过程中壳聚糖衍生物对CTCF/YB-1/C-myc和p53蛋白表达的影响

成功建立了人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养,并利用热休克蛋白(HSP47)和成纤维细胞特异蛋白(FSP)标记物进行了鉴定。研究发现,经过壳聚糖衍生物处理,人增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞在培养中均出现了不同类型的蛋白表达。多功能转录因子蛋白(CTCF)在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕成纤维细胞中出现表达上调;在聚糖衍生物处理的正常皮肤成纤维细胞中数量无变化。YB-1结合蛋白在经壳聚糖处理的正常皮肤成纤维细胞与人增生性瘢痕细胞中的表达几乎无异,但在未经壳聚糖处理的细胞中表达不同。C-MYC和P53蛋白在壳聚糖衍生物处理的增生性瘢痕纤维细胞中表达上调,但在正常皮肤成纤维细胞中,无论是否经过壳聚糖衍生物处理,这两种蛋白都没有表达。上述4种蛋白在人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞中表现出不同的表达方式,这种新型壳聚糖衍生物可能在控制人增生性瘢痕细胞和正常皮肤成纤维细胞生长和增殖过程中起着重要作用。这些蛋白因子的表达机制目前还不是完全清楚,有待于进一步研究。

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。

CTCF介导的拓扑关联结构域边界的预测

转录因子的结合能够影响拓扑关联结构域(TAD)结构,进而限制了调控元件间的相互作用。以GM12878细胞系为研究对象,构建了转录因子CTCF介导的TAD边界和非边界数据集。然后,利用CTCF结合峰强度、模体打分、物种保守性、CTCF结合方向性和CTCF结合密度这五类特征,计算得到了边界和非边界集合的特征矩阵。最后,应用支持向量机(SVM)算法预测了TAD边界。结果表明,CTCF结合峰强度和模体打分具有较好的预测能力,其预测敏感性和特异性指标均高于0.9。