CTLA4-lg融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

目的获得CTLA4全长基因并在真核表达系统中表达。方法通过RT PCR方法 ,从MT2细胞系克隆CT LA4全长基因 ;经引物重叠和半巢式PCR改造 ,获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段DNA ,然后克隆至真核表达载体pIg ,转染COS和CHO K细胞表达。结果获得了CTLA4全长基因 ,序列分析表明 ,该序列与GenBank数据库中的序列一致。在COS和CHO K细胞培养上清中有CT LA4 Ig的表达 ,该产物能抑制淋巴细胞转化。结论真核表达体系表达了有生物学活性的CTLA4 Ig。

腺病毒载体介导的CTLA4-FasL基因转移联合应用供者脾细胞输注促进异基因小鼠皮肤移植耐受

目的:探讨腺病毒介导CTLA4 -FasL基因转移联合应用供者脾细胞输注延长小鼠皮肤移植物存活的作用及其机制。方法:在移植的第0天,C5 7BL 6 (H 2 b,B6 )小鼠经尾静脉注射BALB c(H 2 d)小鼠脾细胞和5×10 9空斑形成单位 毫升(pfu ml)CTLA4 - FasL重组腺病毒(AdCTLA4 - FasL) ,同一天进行皮肤移植,每天观察移植物存活情况。耐受小鼠尾静脉取血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定CTLA4 FasL融合蛋白的体内表达;于第2 0天对受体小鼠进行迟发型超敏反应、单向混和淋巴细胞反应(MLR)、IL- 2逆转试验、过继转移实验和嵌合体检测等耐受状态的检测,以探讨耐受机制。结果:经尾静脉输注供体脾细胞及AdCTLA4 - FasL的B6小鼠,皮肤移植物的平均存活时间达(42 8±2 6 )天(n =6 ) ,而对照的未处理组,绿色荧光蛋白(EGFP)腺病毒处理组,重组腺病毒AdCTLA4Ig组和AdCTLA4 FasL处理组的平均存活时间为(10 .1±0 . 4 1)天(n =6 )、(10-.5±1.4 )天(n =6 )、(12 . 8±1. 1)天(n =6 )、(2 0 .0±2 .5 )天(n =6 ) ,差异具有显著意义(P <0 .-0 1) ;皮肤移植物长期存活的受体小鼠对供体抗原的低应答可以通过脾细胞被过继转移;DTH反应受到抑制、MLR活性特异性降低,且可以被外源性IL 2部分逆转。结论:供体脾细胞输注和腺病毒介导CTLA4 -

CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植的体外实验研究

目的 探索重组腺病毒载体 (Recombinantadenovirus ,rAdv)介导CTLA4Ig基因转染猪皮异种移植免疫耐受的分子机制。方法 构建CTLA4Ig重组腺病毒载体 ,转染猪树突状细胞 (DendriticCell,DC) ,以猪表皮细胞匀浆液为刺激原 ,观察DC递呈猪表皮抗原刺激人T细胞增殖、活化及信号转导的影响 ;同时 ,以CTLA4Ig rAdv转染小鼠DC细胞 ,观察该DC膜表面分子CD40、CD80表达。结果 CTLA4Ig转染DC能显著抑制人外周血T淋巴细胞增殖能力 (P <0 .0 1)和T细胞肌醇磷脂信号系统转导活性 ,IL 2分泌亦受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;转染CTLA4Ig的小鼠DC膜表面分子CD80表达降低 (P <0 .0 5 )。结论 腺病毒介导CTLA4Ig基因转染猪皮能诱导人外周血T淋巴细胞免疫耐受。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的 探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法 供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果 CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。

CTLA4 Ig在诱导小鼠心脏移植免疫耐受中的作用

目的 通过建立小鼠心脏移植模型 ,探讨CTLA4Ig在免疫抑制和诱导免疫耐受中的作用。方法 建立小鼠心脏移植模型 ,供体分别为DBA/2和 6 15新生鼠心脏 ,受体为BALB/c小鼠 ,移植后分别予以CTLA4Ig 0 .1、1、5mg·kg-1·d-1,治疗 1周 ,观察不同剂量CTLA4Ig对新生鼠移植心脏存活时间的影响 ;BALB/c小鼠首次移植 2周后再次移植DBA/2或 6 15新生鼠心脏 ,观察CTLA4Ig对再次移植心脏存活的影响。结果 与对照组相比 ,CTLA4Ig 0 .1mg·kg-1·d组 ,移植心脏的存活时间不能延长 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d和 5mg·kg-1·d-1组能显著延长心脏的存活时间 ,但两组间差异不显著 (P >0 .0 5 )。再次移植 6 15心脏各组 ,移植心脏的存活时间均无显著延长 ,而再次移植DBA/2新生鼠心脏 ,CTLA4Ig 1mg·kg-1·d-1和 5mg·kg-1·d-1组 ,其移植心脏的存活时间仍然能显著延长 (P <0 .0 1)。结论 CTLA4Ig能延长新生鼠心脏移植存活时间 。

CTLA4基因多态性与Graves病的关系

目的 探讨细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）基因单核苷酸多态（SNP）rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804与弥漫性毒性甲状腺肿（Graves）病的关系。方法 以中国安徽蚌埠地区698例Graves病患者（Graves病组）和571名健康体检者（对照组）作为研究对象。应用TaqMan探针技术,分别检测两组的CTLA4基因SNP rs10197319、rs1024161、rs231726、rs231804基因型;同时检测Graves病患者促甲状腺激素受体抗体（TRAb）水平。结果 在4个SNP位点中,rs1024161_A与Graves病易感性显著相关（P=2.28×10-5,OR=1.43,95%CI：1.21~1.68）;Logistic回归分析提示rs1024161是Graves病的独立易感位点。在rs1024161_AA、rs1024161_AG、rs1024161_GG 3种基因型间比较,血清TRAb水平及其他临床表现的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 CTLA4基因上rs1024161与中国安徽蚌埠地区汉族人群Graves病明显相关,并且是一个独立易感位点。

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。 方法 以肾小管上皮细胞(PK 15 )、血管内皮细胞 (ECV 3 0 4)为靶细胞 ,观察感染强度为 10 0、2 0 0、40 0时CTLA4Ig重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率 ;以免疫组化以及Westernblot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。 结果 转染后 2d、4d ,转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异 ;转染后 2 4hCTLA4Ig在PK 15和ECV 3 0 4中的阳性表达率分别为 93 7%和 90 2 % ;Westernblot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。 结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小 ,能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染 ,并使其表达分泌型CTLA4Ig ,具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能 。

CTLA4Ig诱导免疫耐受的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在诱导人外周血T细胞免疫耐受中的作用。方法以结核菌素刺激人外周血淋巴细胞,观察不同剂量CTLA4Ig对外周血淋巴细胞增殖反应的影响;观察CTLA4Ig和CsA(环孢霉素A)对再次结核菌素刺激和非相关第三者APC细胞刺激淋巴细胞增殖反应的影响,IL-2的变化,以及外源性IL-2对免疫耐受诱导的影响。结果CT-LA4Ig抑制淋巴细胞增殖呈剂量依赖关系,20μg/ml时抑制作用最强;CTLA4Ig能诱导免疫耐受并与CsA有协同作用;外源性IL-2能抑制免疫耐受的诱导。结论CTLA4Ig能抑制淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌释放,CTLA4Ig和CsA联合应用能更彻底抑制淋巴细胞增殖和IL-2的分泌释放,并诱导免疫耐受;外源性IL-2能逆转免疫耐受。

大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体的构建、制备及表达

目的检测大鼠CTLA4-FasL重组腺相关病毒载体感染大鼠关节炎性成纤维样滑膜细胞后目的基因的表达。方法构建大鼠CTLA4-FasL融合基因重组腺相关病毒载体,制备重组病毒,体外感染从佐剂诱导关节炎的大鼠关节中分离的炎性成纤维样滑膜细胞,利用Flag标签纯化目的蛋白,ELISA和Western blot等方法检测目的蛋白的表达。结果获得含有大鼠CTLA4-FasL融合基因的重组腺相关病毒,感染炎性成纤维样滑膜细胞后能够分泌性表达目的蛋白。结论构建并制备的CTLA4-FasL重组腺相关病毒能够有效感染炎性成纤维样滑膜细胞并促使期表达CTLA4-FasL融合蛋白,为今后关节炎治疗的体内实验研究奠定了基础。

CTLA4-Ig影响T细胞功能及机理的初步研究

目的 :研究CTLA4 Ig融合蛋白对外周血T淋巴细胞活化的抑制作用及机理。方法 :分离新鲜人外周血单个核细胞 ,观察CTLA4 Ig对淋巴细胞转化和混合淋巴细胞培养的作用 ,用流式细胞术观察CTLA4 Ig对T细胞表面CD2 5表达的影响 ,最后通过EMSA方法检测激活T细胞中核蛋白的变化。结果 :CTLA4 Ig能够抑制淋巴细胞转化和混合淋巴细胞反应 ,减低T细胞表面CD2 5的表达 ,抑制核内与IL 2表达相关的RE AP结合因子的活化。结论 :CTLA4 Ig通过多种信号途径对T细胞的活化起作用 ,其机制之一是抑制核内结合于IL 2增强子RE AP位点的核因子的活化。

CTLA4胞外区蛋白在GS115酵母中的表达和活性鉴定

目的 获取具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。方法 构建CTLA4胞外区 (CTLA412 5)蛋白的酵母表达载体 ,在GS115酵母细胞中表达。通过硫酸铵粗分离和离子交换层析等 ,获取纯化的目的蛋白 ,并在CTLL2细胞中鉴定活性。结果 质粒在GS115酵母中可较高水平地表达CTLA4胞外区蛋白。经纯化后的蛋白可抑制IL 2刺激的CTLL2细胞的增殖。结论 GS115酵母可高效表达具有生物学活性的CTLA4胞外区蛋白。

Tju103和CTLA4-Ig诱导MHC半相合小鼠骨髓移植耐受比较

目的:观察Tju103和CTLA4-Ig各自对MHC半相合小鼠骨髓移植免疫耐受的诱导。方法:半相合供鼠T细胞与受鼠抗原、Tju103(或CTLA4-Ig)共育后与骨髓细胞混合移植,观测移植后受情况。结果:A.单纯照射组:全部小鼠于照射后11d内死于造血衰竭;B.白血病CTX治疗组:全部小鼠于接种白血病细胞后16～23d死于白血病;C.单纯移植组:全部小鼠于移植后21d内死于移植物抗宿主病(GVHD);D.CsA预防组:5只小鼠于移植后8～22d死亡,1只死于白血病,各有2只死于GVHD和感染,5只活过30d;E.Tju103处理组:4只小鼠于移植后9～26d死亡,2只死于GVHD,各有1只死于白血病和感染,6只活过30d;F.CTLA4-Ig处理组:2只小鼠于移植后17～26d死亡GVHD,8只活过30d。结论:Tju103和CT-LA4-Ig均明显延长生存期,降低GVHD发生和严重程度,CTLA4-Ig保留有抗感染和移植抗白血病(GVL)作用,而Tju103没有。

CTLA4Ig局部转基因对小肠移植急性排斥的治疗作用

目的:研究CTLA4Ig基因在移植小肠局部表达及其表达产物对急性排斥反应的治疗作用. 方法:建立SD→Wistar的大鼠异位小肠移植模型,并随机分为实验组(CTLA4Ig转基因组)和对照组(非转基因组). 实验组供肠移植前经肠系膜上动脉注入脂质体包裹的CTLA4Ig cDNA,术后应用免疫组织学检查移植小肠中CTLA4Ig转基因产物的表达.移植术后3,7,10 d分别获取各组的移植小肠进行组织学检查及细胞凋亡测定. 结果:经CTLA4Ig cDNA处理的小肠在移植术后可见大量的CTLA4Ig表达.对照组移植肠在术后7,10 d分别出现I, Ⅱ度急性排斥反应,同时凋亡细胞数量显著增加.实验组移植肠术后未见排斥反应的病理学证据,凋亡细胞偶见. 结论:CTLA4Ig基因可在移植小肠局部转染表达,其表达产物可防止移植术后急性排斥反应的发生.

表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体复性方法探索

探索表达于大肠杆菌中的人源性抗CTLA4单链抗体(Anti-CTLA4-scFv)的体外复性方法.采用稀释和透析两种复性方式,并分析影响复性得率的各种因素如复性时间、温度、适宜的氧化-还原体系对其的影响.通过非还原电泳确定复性效果,并测定蛋白含量.结果显示:含0.15 mol·L-1NaCl、1 μmol·L-1氧化型谷胱甘肽和3μmol·L-1还原型谷胱甘肽的50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液作为Anti-CTLA4-scFv的复性液,4℃下透析复性48～54 h,可获得具有天然构象的蛋白质.该方法复性蛋白得率高,从3.9 g菌体中可复性获得28 mg蛋白.

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现CTLA4Ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

共刺激分子CD28:CTLA4/B7在实验性自身免疫性重症肌无力中的作用

目的研究共刺激分子CD28：CTLA4/B7在实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）发病中的作用。方法将雌性Lewis鼠随机分为EAMG组和对照组;EAMG组采用人工合成的Rα97-116肽段3次法免疫Lewis鼠,对照组同期注入等量的PBS;3次免疫接种后采用流式细胞术检测CD28、B7-2、B7-1、CTLA4在外周血、淋巴细胞、单核细胞中的表达。结果EAMG组大鼠成模率75%;与对照组比较,外周血CD28、B7-2B7-1、CTLA4的表达明显增加（P〈0.05-0.01）;EAMG组大鼠外周血CD28、CTLA4主要在淋巴细胞表达及B7-1、B7-2在淋巴细胞、单核细胞表达显著增加（P〈0.05-0.01）。结论EAMG大鼠存在共刺激分子CD28：CTLA4/B7表达异常,共刺激分子CD28：CTLA4/B7可能参与了EAMG的发生、发展。

GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr^-细胞膜上的表达

目的 :研制GPI锚定修饰的新型免疫抑制分子GPI CT LA4Ig。方法 :通过将从促衰变因子 (DAF)来源的GPI修饰性信号序列与CTLA4Ig嵌合 ,获得GPI修饰的CTLA4Ig分子。将编码GPI CTLA4Ig嵌合分子的基因克隆到真核表达载体pCI dhfr中 ,并用脂质体法转染CHO dhfr 细胞 ,用氨甲喋呤 (MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用RT PCR、ELISA、细胞免疫荧光和Westernblot进行鉴定。最后采用ProteinA亲和层析纯化。结果 :构建了GPI CTLA4Ig嵌合分子 ,并在CHO dhfr 细胞膜上稳定表达。结论 :GPI修饰的CTLA4Ig分子有可能作为新型的免疫抑制剂用于器官移植中 。

CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达

目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。