CTLA4Ig重组腺病毒载体的构建与体外表达

目的 :构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体 ,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。方法 :自行设计一对分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的CTLA4Ig基因上下游引物 ,以质粒PCDNA3 0 /CTLA4Ig为模板 ,通过PCR扩增获得CTLA4Ig基因全部序列。片段回收以后经BglⅡ及HindⅢ双酶切 ,定向插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV的启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间 ,获得重组质粒pAdTrack -CTLA4Ig。通过BglⅡ /HindⅢ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后 ,将正确重组体pAdTrack -CTLA4Ig与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1共转化BJ5 183细菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆 ,提取质粒用脂质体介导转染 2 93细胞 ,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果 :成功构建了含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒 ,病毒滴度为 1 6 5× 10 12 PFU/L。结论 :该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达、研究CTLA4Ig的生物学活性及移植排斥、自身免疫病的基因治疗提供了一定的基础。

人CD_(40)L胞外区和人CTLA_4Ig双基因共表达腺病毒载体的克隆和鉴定

目的 :构建人CD40 L胞外区和CTLA4Ig双基因共表达重组腺病毒载体并鉴定。方法 :RT -PCR扩增人CD40 L胞外区片段 ,与致瘤素信号肽连接后构建穿梭质粒 ,经酶切、插入、同源重组 ,获质粒pAdshCD40 L -IRES2 -CTLA4Ig ,经 2 93细胞包装 ,获共表达双基因的腺病毒pAdvshCD40 L -IRES2 -CTLA4Ig ,并行凝胶电泳、PCR、共聚焦显微镜检测。结果 :电泳、PCR扩增出了 6 0 0bp和 4 0 0bp的特异性片段、共聚焦显微镜观察到CD40 L绿色荧光和CTLA4Ig红色荧光的共表达。结论 :成功构建了人CD40 L胞外区和CTLA4Ig共表达双基因重组腺病毒载体。

CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR产物克隆入pCDNA3，阳性重组子以双酶切和测序鉴定。将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183，经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体。采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步感染HepG2细胞，采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况。【结果】构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒，病毒滴度可达6×10^9pfu／mL，并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig。【结论】成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体，为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。

腺病毒介导CTLA4Ig基因在体外培养细胞中的表达

目的 鉴定腺病毒介导免疫调节基因CTLA4Ig在体外培养细胞中的表达能力和细胞毒性。 方法 以肾小管上皮细胞(PK 15 )、血管内皮细胞 (ECV 3 0 4)为靶细胞 ,观察感染强度为 10 0、2 0 0、40 0时CTLA4Ig重组腺病毒转染靶细胞后不同时相细胞存活百分率 ;以免疫组化以及Westernblot分别检测CTLA4Ig在细胞以及上清中的表达。 结果 转染后 2d、4d ,转染组两种细胞存活百分率与对照组相比无显著差异 ;转染后 2 4hCTLA4Ig在PK 15和ECV 3 0 4中的阳性表达率分别为 93 7%和 90 2 % ;Westernblot检测到两种细胞上清中均有CTLA4Ig表达。 结论 重组腺病毒对非包装靶细胞毒性很小 ,能够介导CTLA4Ig基因对靶细胞的高效转染 ,并使其表达分泌型CTLA4Ig ,具备了以基因治疗诱导免疫耐受的潜能 。

重组腺病毒介导的CTLA4Ig基因在哺乳动物体内表达的研究

目的 了解CTLA4Ig腺病毒在不同哺乳动物体内的转染能力及表达情况。方法 用所构建的CTLA4Ig腺病毒通过静脉或腹腔注射到Balb/c小鼠、Wistar大鼠、兔、小香猪、羊体内 ,应用蛋白质斑点印记检测CTLA4Ig在以上动物血清中的表达情况 ,同时还观察各动物脏器的病理改变及动物的生存情况。结果 重组腺病毒转染 7d后大鼠、小鼠血清中出现CTLA4Ig ,持续表达 2周。各动物未见异常死亡 ,各脏器未见明显病理改变。结论 CTLA4Ig重组腺病毒能够有效转染Balb/c小鼠。

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。

人CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体构建及鉴定

目的 构建并鉴定人CTLA4Ig和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)双基因共表达逆转录病毒载体。方法 利用基因重组技术将IRES序列与CTLA4Ig和EGFP基因构建到逆转录病毒载体中 ,脂质体法将重组质粒pCTLA4Ig IRES2 EGFP转染PA31 7细胞 ,在G41 8选择压力下 ,通过流式细胞检测筛选得到高效共表达CTLA4Ig和EGFP并能产生高滴度重组逆转录病毒的PA31 7细胞克隆 ,MTT法测定CTLA4Ig生物学活性。结果 成功构建出含IRES序列的CTLA4Ig和EGFP双基因共表达逆转录病毒载体 ,生物学活性测定表明CTLA4Ig生物学活性没有受到影响。

腺病毒载体介导CTLA4Ig基因治疗小鼠变应性鼻炎

目的 检测CTLA4Ig 重组腺病毒载体 (Ad CTLA4Ig)在变应性鼻炎治疗中的作用。方法 采用卵清蛋白 (OVA)致敏和激发诱导小鼠变应性鼻炎。实验组在OVA激发前 3 0min予以Ad CTLA4Ig腹腔注射。未转CTLA4IgcDNA的腺病毒载体 (Adv)作对照。比较各组动物鼻部症状和鼻粘膜形态学改变 ,并采用ELISA法测定血清中OVA 特异性IgE水平。结果 CTLA4Ig 重组腺病毒实验组小鼠鼻部症状和鼻粘膜病理改变不明显 ,并且血清中OVA 特异性IgE水平明显低于对照组 (P <0 0 5 )。结论 Ad CTLA4Ig可防治小鼠变应性鼻炎的发生 ,提示CTLA4Ig 重组腺病毒载体有可能运用于临床变应性鼻炎的治疗。

人CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:用AdEasy腺病毒载体系统构建CTLA4Ig重组腺病毒,以感染树突状细胞使其递呈抗原至T淋巴细胞功能受阻.方法:双酶切、凝胶回收方法从质粒pCDM8-CT-LA4Ig提取目的基因CTLA4Ig,构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig;经酶切线性化后的pAdTrack-CTLA4Ig与AdEasy-1进行同源重组,经酶切线性化转染入HEK293细胞进行包装.结果:卡那霉素抗性筛选和PacⅠ酶切确证重组腺病毒质粒pAd-CTLA4Ig,PacⅠ酶切产生30kb和4.5kb2个片断为同源重组.重组腺病毒质粒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为1.6×109).结论:成功构建了携带CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体,为利用CTLA4Ig基因转染树突状细胞的基因治疗奠定了基础.

腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达

目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测Iκ- Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应。结果: ( 1 )构建pAdTrack -CMV- CTLA4Ig IRES2- Iκ-Bα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染 293, 获得重组腺病毒。(2)PCR鉴定重组腺病毒正确。(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后,该腺病毒可表达Iκ- Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF α的产生。结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ- Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达,为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF- κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础。

应用重组腺病毒载体制备人CTLA4Ig融合蛋白

目的 在实验室水平制备并鉴定人CTLA4Ig融合蛋白。方法 将人CTLA4IgcDNA片段构入重组腺病毒载体中 ,用该表达载体感染 2 93细胞并在其中表达人CTLA4Ig ,再应用SPA亲合层析柱自细胞培养上清中纯化出该融合蛋白 ,以WEST ERN印迹验证后 ,观察了所制备CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应的影响。结果 经亲合层析柱洗下的蛋白为分子量为 5 3.0kd的单一组分 ,经WESTERN印迹证实为CTLA4Ig ,并发现所制备CTLA4Ig能呈剂量依赖性抑制混合淋巴细胞反应。结论 本法成功制备了具有生物学活性的重组人CTLA4Ig融合蛋白。

CTLA4Ig-重组腺病毒载体延长大鼠异基因原位移植气管存活期

目的 研究腺病毒介导的CTLA4Ig基因在大鼠异基因原位气管移植中的作用。 方法 建立异基因大鼠原位气管移植模型。分别采用腹腔注射生理盐水 (Saline组 ,2ml/只 )、腹腔注射CTLA4Ig重组腺病毒载体 (Ad CTLA4Ig组 ,2× 10 9PFU/只 )和肌肉注射环胞素A(CsA组 ,5mg/kg) ,观察术后大鼠的存活时间和移植气管的病理改变。 结果 Ad CTLA4Ig组大鼠存活时间为(2 7 3± 5 88)d ,较Saline组 (7 3± 1 63 )d和CsA组 (18 3± 1 70 )d明显延长 (P <0 0 5 )。同时 ,术后 10dAd CTLA4Ig组大鼠气管组织学改变与CsA组大鼠比较无明显差异。结论 Ad

介导CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体对烧伤创面皮片移植的影响

目的探讨重组CTLA4Ig及IκBα重组腺病毒载体延长烧伤创面皮片移植存活情况。方法采用Wistar大鼠36只,随机分为3组,1组:正常对照组,2组:用AdCTLA4Ig液室温浸泡转染1h,3组:用Adv CD40LIg-IRES2-CTLA4Ig液室温浸泡转染1h。麻醉后常规背部备皮,在4cm×4cm面积上涂3%凝固汽油2ml,燃烧20s,致大鼠背部皮肤Ⅲ度烧伤,于烧伤后第3天,将所制备1.0cm×2.0cm大小长方形皮瓣移植于创面,加压包扎。观察重组腺病毒载体转染移植物后,在大鼠背部烧伤创面移植人断层皮肤的存活情况的影响。结果重组腺病毒载体能延长大鼠烧伤创面移植人断层皮肤的存活时间。结论重组腺病毒可用于延长烧伤创面异基因移植皮肤的存活期。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

腺病毒介导CTLA4Ig转染正常人肝细胞株的研究

目的研究腺病毒介导CTLA4Ig基因转染正常人肝细胞株L02后,CTLA4Ig在L02细胞内的表达、生物学活性以及对L02细胞生物学特性的影响。方法重组腺病毒载体Ad-CTLA4Ig-EGFP转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察绿色荧光在细胞内的表达情况。以免疫细胞化学、Western blot、ELISA等方法检测CTLA4Ig在L02细胞内、外的表达情况;通过绘制细胞生长曲线、检测尿素合成能力观察转染前后L02细胞的生物学特性;转染后的L02细胞与大鼠脾脏细胞共培养,通过检测脾脏细胞增殖情况评价表达CTLA4Ig的L02细胞在体外的免疫耐受活性;收集共培养体系中的大鼠脾脏细胞,再分别与正常L02细胞、HeLa细胞共培养,检测脾细胞增殖情况以评价转染后L02细胞免疫耐受的特异性。结果转染后的L02细胞可在细胞质内大量表达CTLA4Ig蛋白,并分泌至培养上清中;转染后L02细胞生长速度无明显改变(P>0.05),单个细胞尿素合成能明显升高[(0.56±0.01)pmol/d,P<0.01];转染后的L02细胞在体外可显著抑制大鼠脾脏细胞的增殖(抑制率约为36.8%,P<0.05),被抑制后的大鼠脾脏细胞在正常L02细胞刺激下增殖较低,但在HeLa细胞刺激下则可显著增殖(P<0.01)。结论Ad-CTLA4Ig-EGFP转染后的L02细胞可表达具有生物学活性的CTLA4Ig,并在体外表现出显著的具有抗原特异性的免疫抑制活性。

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓间质干细胞体外抑制免疫应答的研究

目的:通过腺病毒载体介导CTLA4Ig在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达,探讨MSC作为基因转移靶细胞的可行性和转染效率,研究其在体外对免疫应答的抑制作用。方法:构建含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒载体pad-CTLA4Ig,按照不同的感染倍率(MOI)转染大鼠MSC,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,流式细胞术、Western blotting等方法检测目的蛋白CTLA4Ig在MSC中的表达。将转基因MSC加入混合淋巴细胞反应(MLR)体系,观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应。结果:重组腺病毒载体pAd-CTLA4Ig对MSC的最大转染率为80.7％±4.7％,转基因MSC可检测到目的蛋白的表达。基因修饰的MSC能有效抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,4d达到最大抑制效率51.46％;再次MLR证实这种抑制作用是供者特异性的。结论:MSC是一种较理想的基因转移靶细胞,其表达的转基因产物CTLA4Ig可在体外特异性地抑制免疫应答。

CXCR4腺病毒表达载体的构建及其在真皮多能干细胞中的表达

目的构建大鼠CXCR4的腺病毒表达载体,并观察其转染真皮多能干细胞(dermalmultipotentstemcells,dMSCs)后的表达情况。方法扩增含有CXCR4的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,再与pAdEasy1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有CXCR4的骨架质粒(pAdEasy/CXCR4)。将验证正确的pAdEasy/CXCR4用PacⅠ酶切后转染293细胞,从而包装出CXCR4的腺病毒表达载体(AdvCXCR4)。用AdvCXCR4转染dMSCs,并采用RTPCR、免疫荧光细胞化学和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况。结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将CXCR4全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体。同时,AdvCXCR4转染dMSCs后可有效地增加dMSCs中CXCR4的表达。结论CXCR4的腺病毒表达载体的成功构建和其在dMSCs中的表达,为研究CXCR4在干细胞移植中的应用奠定基础。

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞诱导特异性免疫耐受的实验研究

目的 通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs)中的表达 ,探讨CTLA4Ig体外诱导特异性免疫耐受的机制 ,为该基因修饰的BMSCs联合造血干细胞移植 (hematopoieticstemcelltransplantation ,HSCT) ,达到预防移植物抗宿主病 (graft versus hostdisease ,GVHD)和纠正预处理损伤的造血微环境 (hematopoieticinductivemicroenvironment,HIM)积累实验依据。方法 以CTLA4Ig 重组腺病毒按感染复数 (mutiplicityofinfection ,MOI) 5 0转染BMSCs,利用亲和层析的方法纯化培养上清中的目的蛋白CTLA4Ig ,加入到混合淋巴细胞反应 (mixedlymphocytereaction ,MLR)体系中 ,通过MTT显色观察其抑制淋巴细胞增殖的生物学效应 ,以ELISA检测体系中IL 2的水平。结果 纯化的CTLA4Ig对MLR反应体系中淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用 ,且在一定范围内与CTLA4Ig的浓度呈依赖性关系 ;体系中IL 2水平与淋巴细胞数有相似的变化趋势 ,且成正相关 (γ =0 85 2 2 ) ;CTLA4Ig组的淋巴细胞数与IL 2水平与对照组相差显著 (P <0 0 5 )。结论 转染后BMSCs表达的目的蛋白CTLA4Ig能有效阻断B7/CD2 8共刺激信号途径 ,从而抑制T细胞活化 ,抑制IL

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1(+)-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。