真核表达载体pcDNA3-CTLA4lg的构建及体内表达

背景:CTLA-4lg的制备过程比较复杂,单克隆抗体的价格比较昂贵,而且应用CTLA-4lg单克隆抗体注射本身存在着血浆药物浓度不稳定的问题。目的:探讨Ctla4lg表达质粒构建的可行性。设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2005/2006在中国医科大学中心实验室完成。材料:雄性Wistar大鼠10只,近交系昆明小鼠10只。方法:提取Wistar大鼠总RNA,反转录成cDNA第1链,PCR扩增CTLA4基因,将其和真核表达载体pcDNA3酶切、连接。转化感受态菌DH5α,培养后挑取阳性克隆、提取质粒,酶切鉴定重组子、测序,最后转染近交系昆明小鼠,应用Westen Blot法检测血清CTLA4lg水平。主要观察指标:构建的Ctla4lg表达质粒基因序是否正确以及能否在小鼠体内进行蛋白表达。结果:对含有pcDNA3-CTLA4质粒的LB菌液进行鉴定测序,目的基因片断大小为288bp,与Genebank上公布的CTLA4序列完全一致,质粒构建正确。利用阳性脂质体载体包被pcDNA3-CTLA4lg转染小鼠,有3只在第7天血清检测CTLA4Ig阳性,显示pcDNA3-CTLA4lg能够在鼠肌细胞内表达。结论:利用基因合成和重组技术成功构建了真核表达载体pcDNA3-CTLA4Ig,利用脂质体法成功的将pcDNA3-CTLA4lg转染到鼠肌细胞内并进行表达。

人CTLA4Ig腺病毒载体的构建及其生物学功能研究

目的:通过同源重组构建CTLA4Ig腺病毒载体,研究其生物学活性,并用于基因治疗诱导心脏移植耐受。方法:通过基因重组技术,将CTLA4Ig基因克隆至腺病毒穿梭质粒pCA13中。然后将该质粒与腺病毒辅助质粒同源重组,经过293细胞包装,构建CTLA4Ig腺病毒载体。用RT-PcR、SDS-PAGE及Western blot等技术,检测包装的病毒感染293细胞后CTLA4Ig蛋白的表达及分泌,通过体外实验,观察病毒感染的293细胞上清对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。通过大鼠体内实验,检测用CTLA4Ig腺病毒载体基因治疗后,CTLA4Ig在体内的表达。结果:CTLA4Ig腺病毒载体构建成功。体外实验证实,CTLA4Ig腺病毒感染的293细胞上清液,能够抑制异基因脾细胞的单向MLR。体内实验表明,经过静脉途径给予受体大鼠CTLA4Ig腺病毒载体,能够诱导移植耐受,延长心脏移植物的存活。结论:构建的CTLA4Ig腺病毒载体,体外感染293细胞能够分泌CTLA4Ig蛋白。该蛋白可抑制T细胞的活化,CTLA4Ig腺病毒载体可用于体内基因治疗诱导移植耐受。