猪源伪狂犬病病毒传代致弱LA2017株的安全性和免疫效力研究

为检测猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株作为疫苗后选株的安全性及免疫效力。本研究对4日龄初生仔猪和产前1个月妊娠母猪免疫LA2017株后的安全性、28~35日龄仔猪免疫效力以及免疫猪后排毒和同群传播性进行了研究。结果显示:滴鼻接种4日龄仔猪和肌肉注射产前1个月的妊娠母猪,均无任何临床症状,表明该疫苗株具有良好的安全性;肌肉注射接种28~35日龄的仔猪,免疫后7 d产生对PRV变异株AH02LA的完全保护并且可以阻止排毒,免疫14 d后攻毒均未发病和排毒,而PRV Bartha K61株免疫猪后7 d攻毒,有4头猪出现了体温升高,鼻拭子样品均检出病毒,免疫后14 d和21 d时对试验猪攻毒,PRV Bartha K61株免疫组均有猪发病,且鼻拭子样品均检出病毒;在抗体产生水平方面,PRV LA2017株免疫后14 d产生高水平中和抗体,PRV中和指数抗体≥10 000,且维持至免疫后5个月,而Batha-K61组免疫后1个月至3个月针对PRV变异株AH02LA的中和指数仅为178~1000,且4个月就开始下降;在同群感染方面,PRV LA2017株肌肉注射接种28~35日龄仔猪后14 d内均未从鼻拭子和肛门拭子检出排毒,gB抗体全部转为阳性,同群非免疫接种猪PRV gB和gE的ELISA抗体均为阴性,表明PRV LA2017株安全性好,无横向传播,不引起同群感染。结果表明,PRV LA2017株作为疫苗株对猪伪狂犬变异株的保护效果显著优于Bartha K61株,该毒株安全性好、抗体水平高和持续时间长,是一株极具开发价值的猪伪狂犬病流行株的弱毒疫苗候选株。

狂犬病毒CTN-1v株毒种的不良反应与免疫学效果研究

目的 观察CTN - 1v株毒种的不良反应及免疫学效果。方法 选择 2 0例健康者接种应用CTN - 1v株毒种制备的狂犬病疫苗 ,观察接种者的不良反应进行中和抗体测定。结果 接种者的不良反应率为 35 % (7/ 2 0 ) ,中和抗体阳转率为 10 0 % ,免疫后 14天中和抗体水平平均为 13 0 8IU/ml(5 83～ 2 2 16IU/m1)。结论 CTN - 1v株毒种 ,不良反应轻微而且免疫原性良好 。

应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。

伪狂犬病弱毒克隆株LY-C6株的试验免疫研究

在流行病学调查中分离到 1株病毒 ,经鉴定为伪狂犬病毒弱毒株命名为LY株。应用蚀斑筛选方法对其进行了蚀斑克隆纯化 ,将克隆后的该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LY -C6株。克隆株除对家兔有一定致病力外、对 5日龄乳猪及妊娠母猪都有很高的安全性。该克隆株对新生乳猪、断乳仔猪及妊娠母猪的最小免疫量分别为 1 0 2 80 、 2× 1 0 2 80 、 4× 1 0 2 80 TCID50 ,抗体中和指数达到 3 1 6可获得攻毒保护 ,对新生乳猪、断乳仔猪的免疫持续期为 2 40天 ,免疫妊娠母猪其后代可获高滴度的母源抗体 ,至少可使 2

伪狂犬病弱毒株的分离鉴定及生物学特性的研究

在流行病学调查中分离到 1株病毒 ,经鉴定为伪狂犬病弱毒株 ,定名为 F971株。分离病毒经克隆纯化后测得其毒价为 10 7.59TCID50 / ml,通过细胞中和试验表明分离病毒能有效地被猪伪狂犬病毒闽 A株阳性血清中和。病毒在电镜下可以清楚地观察到囊膜及外周纤突。分离株对 3日龄乳鼠有一定的致病力 ,但对家兔、3日龄乳猪及妊娠母猪都有很高的安全性。用不同的剂量 10 0 、10 -1、10 -2 肌肉注射 3日龄乳猪后 14天用10 5.7TCID50 伪狂犬病强毒攻击 ,所有试验仔猪均得到保护。用分离株免疫母猪 ,其后代可获高滴度的母源抗体 ,15日龄的仔猪能抵御 10 5.7TCID50 强毒的攻击。用 EL ISA普查试剂盒测定免疫猪抗体 ,结果均为阳性 ,而用 g I- ELISA试剂盒测定抗体时 ,结果均为阴性。证明分离株具有缺损 g I糖蛋白的特性。综合上述特性 ,确定F971为 1株 g I糖蛋白缺损的猪伪狂犬病弱毒株。

伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失弱毒株的制备

为了降低伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)QD株毒力,获得候选疫苗株,试验通过同源重组方法同时缺失非必需蛋白gE和gI,构建含同源臂及EGFP表达盒片段的重组质粒pB-arm、pB-EGFP-arm,将重组质粒pB-EGFP-arm与母本毒株PRV QD基因组共转染至PK-15细胞后通过蚀斑纯化得到PRV QD-gE^(-)/gI^(-)/EGFP+株,再将重组质粒pB-arm与PRV QD-gE^(-)/gI^(-)/EGFP+株基因组共转染至PK-15细胞,通过蚀斑纯化删除EGFP基因得到PRV QD-gE^(-)/gI^(-)株;采用PCR扩增和Western-blot分别测定PRV QD-gE^(-)/gI^(-)株gE、gI基因mRNA转录和gE蛋白表达情况;绘制缺失毒株的增殖曲线并测定缺失基因的传代稳定性,比较缺失毒株与母本毒株的小鼠半数致死量(LD50)差异。结果表明:PRV QD-gE^(-)/gI^(-)株无gE和gI基因mRNA转录,gE蛋白未表达。缺失毒株对PK-15细胞的半数感染量(TCID50)为1×10^(-8.65)/0.1 mL,与母本毒株比较差异不显著(P>0.05),连续传至15代时缺失基因未改变。缺失毒株对小鼠的LD50为1×10^(-1.84)/0.2 mL,低于母本毒株的1×10^(-4.16)/0.2 mL。说明PRV QD株通过缺失gE和gI基因后毒力减弱,可作为制备PRV疫苗的候选毒株。

应用复合多聚酶链反应方法快速鉴别伪狂犬病弱毒疫苗与野毒

本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计并合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２），以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼脂糖凝胶电泳显示，从所有１１株野毒ＤＮＡ中都扩增出３７２ｂｐ和５２６ｂｐ两个片段，而Ｂａｒｔｈａ－ｋ６１只扩增出３７２ｐｂ一个片段。酶切分析证明ＰＣＲ产物是特异性的。ｇＢ基因是ＰｒＶ主要保护性抗原基因，是病毒复制必需的，强弱毒都有此基因；Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株是ｇＥ基因缺失的弱毒。所以，本实验建立的方法通过１次ＰＣＲ即可有效鉴别疫苗毒与野毒。这一方法将在今后根除伪狂犬病计划中发挥重要作用。

C株猪伪狂犬病疫苗免疫效果评价

越来越多的文献证实,国内流行的猪伪狂犬病毒株已经发生变异,其毒力、致病特点已经有了明显不同,因此很多人开始质疑经典毒株对新流行毒株的保护力。目前,国内很多疫苗厂家已经将猪伪狂犬病疫苗毒株更换为新的变异毒株,将其缺失致弱后用作疫苗株,比较知名的如HB-2000株、C株等。猪伪狂犬病病毒C株的不同之处在于其是自然致弱的毒株,病毒培养效果更好,容易收获更高的毒价,但其确切的效果还需要逐步验证。

狂犬病病毒减毒株CTN-181毒力减弱的分子基础研究

目的了解CTN-181弱毒株的全长基因结构及其毒力减弱的分子基础。方法将CTN-181的全长基因进行测序并与4株减毒疫苗株和5株街毒株进行全序列基因比对,与CTN-181株的母株CTN-1进行不同区段蛋白基因中的替换位点比较。结果全长基因比较显示,CTN-181株与其他9株狂犬病病毒的核苷酸和氨基酸同源性为81.4%～93.3%和86%～97%。与CTN-1母株比较,CTN-181株存在12处核苷酸和7处氨基酸突变,氨基酸突变位点发生在N157(N→S),M187(Q→P),G276(L→V),G333(R→Q),G336(N→D),G389(E→K)和L1061(S→N)。结论 CTN-181存在7处氨基酸突变,可以认为是其毒力减弱的分子基础,其中在G蛋白内的4个位点的氨基酸突变最为重要。

抗猪伪狂犬病毒免疫球蛋白(Ig)研制试验与检测结果

本试验用配有佐剂的伪狂犬病毒抗原,按特定基础免疫与强化免疫程序接种关中毛驴,用两次盐析法沉淀提取抗猪伪狂犬病毒Ig,其中对提纯工艺所涉及的PH值,温度,硫酸铵浓度等进行探索比较,继之对单位体积内的蛋白浓度,酶标抗体效价和稀释度进行了标化,同时对质量检测进行了平行性分析,本实验以陕西关中毛驴作为免疫反应供浆动物;研制用于预防和治疗抗猪伪狂犬病免疫球蛋白(Ig)生物制剂获得理想结果犤1-4犦。经8省(区)、市试用后,深受用户和兽医防疫部门的一致好评和欢迎。

一株狂犬病病毒减毒株CTN-181的表型特性研究

目的全面了解狂犬病病毒减毒株CTN-181的表型特征,并与其亲本株CTN-1进行比较。方法将CTN-181株病毒在BHK21细胞中培养,观察其细胞病变和空斑形成特性;用细胞培养的病毒以脑内、肌内和口腔的方式接种不同周龄的小白鼠,同时脑内接种家兔和豚鼠,以同法接种其亲本株CTN-1进行毒力比较。另外,将病毒在BHK21细胞连续传10代,在乳鼠脑内传3代观察其弱毒特性的稳定性。结果 CTN-181株在BHK21细胞上培养出现较CTN-1株明显的细胞病变、较高的空斑滴度。CTN-181株对家兔、豚鼠脑内接种不致病,对4周龄以上的小鼠任何途径接种均不致病,而其亲本株CTN-1株对这些动物均致病或致死。CTN-181株通过细胞传10代和乳鼠脑内传3代后减弱的毒力未回升,无弱毒返祖现象。结论 CTN-181是一株减弱且稳定的减毒株,其弱毒的表型特征与WHO推荐用于制备动物和犬的口服疫苗株SAG2相似。

犬用口服狂犬病减毒活疫苗安全实验研究

目的:探讨犬用口服狂犬病减毒活疫苗(CTN-22毒株)的安全性。方法:依照WHO 专家会议关于犬和野生食肉动物口服狂犬病疫苗接种现场试验要求和标准的报告,以及美国动物与动物制品法规—兽医生物制品标准,进行本疫苗的安全性试验。结果:口服免疫的5只猫和口服、注射免疫的各5只黄毛鼠,观察21d,无任何症状发生,均健康存活;用本疫苗10个现场使用量的1ml,各对5只家犬肌肉和大隐神经及其周围组织浸润注射后,观察3～35d,无狂犬病症状,并按方法中所规定时间淘汰犬,剖取颈淋巴结、脑、唾液腺等组织分离病毒,均为阴性;3月龄10只犬以10个现场剂量口服免疫后,1、2、3d连续3次取唾液进行病毒分离亦均阴性,免疫后观察6个月未显示狂犬病任何征象,均健康存活。结论:证实CTN-22毒株制备的犬用口服狂犬病减毒活疫苗是安全的。

犬用口服狂犬病减毒活疫苗实验研究

本次实验旨在观察犬用口服狂犬病减毒活疫苗的免疫效果.疫苗剂量每只犬一次口服4ml,疫苗用凉水(4ml)融化,加入冷玉米粥内,立即令犬舔食.现场实验3000余只犬健康存活.此疫苗免疫家犬阳转率100%,血清中和抗体几何平均滴度(GMT)6个月为76.15个月为34,表明有效中和抗体可达1年之久.1年后加强免疫,中和抗体迅速回升.而且满度较高(GMT125),说明本疫苗具有良好的免疫原性和稳定性,同时证实该疫苗口服简便、安全、有效.

犬用口服狂犬病减毒活疫苗猴体安全性试验研究

目的:进一步研究犬用口服狂犬病减毒活疫苗CTN-22毒株的安全性。方法:用高于现场用量4倍浓度疫苗肌肉注射猴体后,采血进行中和抗体检测。结果:猴体肌肉注射疫苗后,均健康存活,中和抗体1个月为1∶13.8～19.5,2个月上升为1∶33.5～1∶37.6。结论:迸一步证实了CTN-22毒株制备的犬用口服狂犬病减毒活疫苗是安全的、可靠的。

伪狂犬Bartha-K61株弱毒疫苗临床应用效果研究

猪伪狂犬病毒属于双链DNA病毒,相对稳定,只有一个血清型,目前为止还未发现抗原性不同的伪狂犬病毒毒株。2011年以来猪伪狂犬病有所抬头,多个地区猪场、实验室检测分离出变异的PRV毒株,它们对易感猪的致病力增强,免疫猪的保护力也相应减弱。

Bartha-K61株净化猪伪狂犬病应用试验

一、猪场信息福建某规模化种猪场,基础母猪800头,自2014年以来一直使用某疫苗厂家生产的猪伪狂犬病(PR)弱毒活疫苗(Bartha—K61株),猪群生产成绩稳定,健康状况良好,连续抽样监测显示种猪群gE抗体阳性率低于10%,并于2016年正式展开猪群伪狂犬病野毒免疫净化工作,2018年顺利通过国家相关部门验收工作。

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。

伪狂犬病病毒弱毒株LY株的分离鉴定

从辽阳某猪场的 1 0日龄仔猪中分离到 1株病毒 ,经纯化后测得其毒价为 1 0 7.2 9TCID50 / m L。细胞中和试验表明 ,该病毒能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清所中和。电镜下可见到典型的疱疹病毒粒子 ,具有囊膜及外周纤突。所分离的病毒对氯仿、胰蛋白酶、乙醚敏感 ,在 p H5 .0～ 9.0下稳定 ,5 6℃ 30 m in可以灭活。应用特异性引物 ,通过 PCR能扩增出伪狂犬病病毒 1 2 4 0 bp的 g D基因。分离病毒对 3日龄乳鼠有一定的致病力 ,但对家兔、3～ 5日龄仔猪及妊娠母猪都有很高的安全性。用不同剂量的病毒培养液肌肉注射于 3～ 5日龄仔猪 ,1 4 d后用 1 0 5.7TCID50 伪狂犬病病毒强毒攻击 ,所有试验仔猪均可得到有效保护。用分离毒免疫母猪 ,其后代可获高滴度的母源抗体 ,1 5日龄的仔猪能抵抗1 0 5.7TCID50 强毒的攻击。试验的结果初步说明 ,所分离的病毒为伪狂犬病病毒 (命名为 PRV L Y株 ) ,并可能是一株弱毒株 。

狂犬病病毒弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立

目的构建狂犬病病毒弱毒疫苗株SRV9全长cDNA感染性克隆,并建立其反向遗传操作系统。方法通过DNAStar对狂犬病病毒SRV9株全长基因组序列进行分析,利用单一的酶切位点,将SRV9全长cDNA分为4段,根据每段重叠区域的酶切位点拼接全长,分别连入pCI和pCDNA3.1(+)载体,并通过PCR方法分别在全长序列的3′端和5′端引入核酶HamRZ和HdvRZ序列,构建全长真核表达质粒pCI-SRV9和pD-SRV9。同时构建能表达狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)的4个辅助质粒。分别将pCI-SRV9或pD-SRV9与辅助质粒通过脂质体共转染BSR细胞,拯救重组病毒。结果两种质粒表达系统均可拯救到有感染活性的病毒粒子,但pD-SRV9表达质粒的拯救效率(8/8)较pCI-SRV9表达质粒拯救效率3/30高;重组病毒与母本野生病毒的体外生长动力学曲线相一致,相同培养时间的病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建了狂犬病病毒弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,为进一步研究狂犬病病毒致病机理、筛选新型狂犬病疫苗或开发基于狂犬病病毒载体的其他疾病疫苗奠定了基础。

多重突变产生的狂犬病活疫苗及其安全性与效力的评估

狂犬病病毒G蛋白的333位点上氨基酸的替换可决定其致病性：此位点具Arg或Lys的毒株，脑内接种后可杀死成年小鼠；而具其他氨基酸的毒株只引起非致死性感染。基于这些发现，已建立了一些狂犬病病毒弱毒株并用作主要是野生动物的口服疫苗，但考虑到有突变返回形成毒力表型的可能性，通过不只是在G蛋白内也在其他蛋白内多重突变产生的弱毒株作为安全的活疫苗应该更为适宜。