三七总皂苷调控CTRP6/RhoA/Rock对骨质疏松大鼠的保护作用机制研究

目的:探究三七总皂苷对骨质疏松大鼠的保护作用及机制。方法:雌性SD大鼠50只,随机分为假手术组、模型组、三七总皂苷组(40 mg/kg)、三七总皂苷+si-NC组(40 mg/kg三七总皂苷组+4 nmol/kg si-NC)、三七总皂苷+si-CTRP6组(40 mg/kg三七总皂苷组+4 nmol/kg si-CTRP6),每组各10只。除假手术组外,其余各组均采用双侧卵巢切除法构建骨质疏松症大鼠模型。选模成功后,各组采用相应药物干预10周。检测血清雌二醇(E_(2))、骨代谢相关指标[Ca、P、1,25(OH)_(2)D_(3)]、炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平以及氧化应激(SOD、GSH-Px、MDA)水平;苏木素-伊红染色观察股骨组织病理学变化;显微CT分析股骨骨微结构变化;Western blot检测大鼠股骨组织CTRP6/Rho A/Rock通路蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠股骨组织出明显病理损伤,血清E_(2)、Ca、P和1,25(OH)_(2)D_(3),SOD、GSH-Px水平均降低(P<0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平均升高(P<0.01),股骨组织CTRP6表达降低(P<0.01),GTP-Rho A/Rho A、Rock1/Rock2比值均增加(P<0.01)。与模型组比较,三七总皂苷组大鼠股骨组织损伤减轻,血清E_(2)、Ca、P和1,25(OH)_(2)D_(3),SOD、GSH-Px水平均升高(P<0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平均降低(P<0.01),股骨组织CTRP6表达增加(P<0.01),GTP-Rho A/Rho A、Rock1/Rock2比值均降低(P<0.01)。与三七总皂苷组比较,三七总皂苷+si-CTRP6组大鼠上述指标均被显著抑制(均P<0.01)。结论:三七总皂苷能够改善骨质疏松模型大鼠股骨组织的损伤情况,其机制与调控CTRP6/Rho A/Rock通路,抑制炎症与氧化应激相关。

L-3-正丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及其机制

目的 基于RhoA/ROCK信号通路探讨L-3-正丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, NBP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠的疗效及潜在机制。方法 32只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、EAE组、NBP低剂量组(L-NBP)和NBP高剂量组(H-NBP),每组8只。使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55, MOG35-55)作为抗原乳剂免疫诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型。EAE模型制作成功后,L-NBP组和H-NBP组分别以3.25,6.5 mg/(kg·d)NBP腹腔注射,连续28 d。免疫当日起,每7 d记录各组小鼠的体质量,每天进行神经功能障碍评分;对脊髓组织进行HE染色和劳克坚牢蓝(Luxol fast blue, LFB)染色,观察病理改变;使用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测外周血白细胞介素-10(IL-10)、IL-1β、IL-6和IL-18含量;real time-PCR检测脊髓组织炎症相关因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF受体1(TNFR1)、IL-1β的表达;Western blot检测RhoA、ROCKⅠ及ROCKⅡ蛋白表达情况。结果 与对照组相比,EAE组小鼠体质量下降,神经功能障碍评分、组织病理学评分升高,IL-10含量降低,IL-18、IL-6和IL-1β含量增加,TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表达升高,RhoA、ROCKⅠ及ROCKⅡ蛋白表达增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与EAE组相比,L-NBP和H-NBP组小鼠体质量增加,发病潜伏期延长,高峰期延迟,神经功能障碍评分、组织病理学评分降低,IL-10含量增高,IL-1β、IL-6和IL-18含量降低,TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表达降低,RhoA、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与L-NBP组相比,H-NBP组小鼠体质量增加,发病潜伏期延长,高峰期延迟,神经功能障碍评分、组织病理学评分降低,IL-10含量增高,IL-1β、IL-6和IL-18含量降低,TNF-α、TNFR1和IL-1β mRNA表达降低,RhoA和ROCKⅡ蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NBP能够减轻EAE小鼠外周及中枢炎症反应,进而改善EAE的神经障碍症状,其作用机制可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路来实现的。

益肾化湿颗粒通过RhoA/ROCK1信号通路对糖尿病肾病炎症的影响

目的探讨益肾化湿颗粒通过RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)1信号通路对糖尿病肾病炎症的影响。方法SD大鼠分为对照组、糖尿病肾病组、干预组,构建糖尿病肾病模型,干预时间为4周。留取血清、尿液,检测24 h尿蛋白定量、血肌酐、血糖、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。留取肾组织,光镜下观察肾组织病理改变,Western blot检测肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白的相对表达情况。结果动物模型建立前,3组大鼠体重、血糖、血肌酐比较,差异无统计学意义(P>0.05)。药物干预前,与对照组比较,糖尿病肾病组24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.05),而干预组与糖尿病肾病组以上指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。药物干预后,与糖尿病肾病组比较,干预组24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。对照组肾组织的肾小球结构完整,糖尿病肾病组肾小球、肾小管提示中晚期改变,干预组较糖尿病肾病组有减轻。与对照组比较,糖尿病肾病组肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相对表达水平升高(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,干预组肾组织ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相对表达水平降低(P<0.05)。结论益肾化湿颗粒通过RhoA/ROCK1信号通路减轻糖尿病肾病炎性因子的表达延缓糖尿病肾病进展。

人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制

目的探讨重组人红细胞生成素(rhEPO)对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)转分化过程中炎性因子的变化及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞,采用随机数字表法分为空白对照组(未加任何刺激物)、高糖诱导组(高糖终浓度为30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇为24.5 mmol/L)、rhEPO对照组(rhEPO终浓度为20 U/ml)、不同浓度rhEPO干预组(rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/ml+高糖)及Rho激酶抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为30μmol/L,加入Y27632 30 min后加高糖,高糖终浓度为30 mmol/L),以上各组均培养24 h。采用RT-PCR检测各组细胞RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平;采用细胞免疫荧光法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测人纤维连接蛋白(FN)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平。结果各组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中高糖诱导组与5 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均高于空白对照组,10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组及Rho激酶抑制剂组RhoA 、ROCK1 mRNA表达均低于空白对照组(P<0.05);不同浓度rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于高糖诱导组(P<0.05),Rho激酶抑制剂组ROCK1 mRNA表达低于高糖诱导组(P<0.05);10 U/ml rhEPO组与20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于5 U/ml rhEPO组(P<0.05);20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于10 U/ml rhEPO组(P<0.05)。各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中高糖诱导组、不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均高于空白对照组,E-cadherin均低于空白对照组(P<0.05);不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于高糖诱导组,E-cadherin均高于高糖诱导组(P<0.05);10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组(P<0.05);Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组(P<0.05);20U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组,E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO组(P<0.05);Rho激酶抑制剂组α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组(P<0.05)。Pearson直线相关结果分析,高糖诱导组、不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关(r=0.885、0.901、0.886、0.868,P<0.05)。结论 rhEPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化,rhEPO还可以通过减少炎性因子的产生,减轻炎性反应,从而延缓糖尿病肾病(DN)的进展,延缓肾间质纤维化,其机制可能与RhoA /ROCK信号通路有关。

rHuEPO对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制

目的临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展,却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,r Hu EPO)对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组:空白对照组、r Hu EPO对照组(20 U/m L r Hu EPO)、清蛋白刺激组(5 mg/m L清蛋白)、5 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+5 U/m L r Hu EPO)、10 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+10 U/m L r Hu EPO)、20 U/m L r Hu EPO干预组(5 mg/m L清蛋白+20 U/m L r Hu EPO)、Rho激酶抑制组(10μmol/L Y27632+5 mg/m L清蛋白),各组均作用24 h。观察各组细胞形态的变化;RT-PCR检测各组细胞Rho A、ROCK1 mRNA及白细胞介素-6因子(interleukin-6,IL-6)mRNA含量水平;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、IL-6蛋白的含量表达。结果空白对照组、r Hu EPO干预组显示鹅卵石或者铺路石样形态,清蛋白刺激组表现出细长梭状改变,呈现纤维细胞样外观。5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组细胞向鹅卵石样复转,Rho激酶抑制组细胞形态呈椭圆形、细胞间隙稍增大;与空白对照组比较,清蛋白刺激组Rho A、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA显著升高(P<0.05),而5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组逐渐下调(P<0.05),且与r Hu EPO浓度负相关;与清蛋白刺激组比较,Rho激酶抑制组ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA表达下调(P<0.05),但Rho A mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA结果显示:清蛋白刺激组上清液TNF-α、IL-6蛋白[(1 347.54±41.52)ng/L、(884.62±0.73)pg/L]表达较空白对照组[(452.32±33.23)ng/L,(95.12±0.32)pg/L]显著增高(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组、Rho激酶抑制组TNF-α表达[(1 003.32±3.42)、(821.32±21.32)、(590.15±7.68)、(488.13±65.03)ng/L)]较清蛋白刺激组[(1 347.54±41.52)ng/L]下降(P<0.05)、IL-6蛋白表达[(656.68±0.55)、(422.35±0.22)、(217.32±0.35)、(309.49±0.21)pg/L]亦较清蛋白刺激组[(884.62±0.73)pg/L]下降(P<0.05),5、10、20 U/m L r Hu EPO干预组组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可能通过减少炎症因子的产生来抑制清蛋白诱导的HK-2细胞转分化过程,其作用机制部分涉及Rho A/ROCK信号通路。

全反式维甲酸对高糖环境下HK-2细胞炎症因子表达的影响

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对高糖环境下正常人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)炎症因子表达的影响及其可能机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组:空白对照组,高糖组(D-葡萄糖30 mmol·L^(-1)),高渗组(甘露醇24.5 mmol·L^(-1)),ATRA干预组[包括高糖+低浓度ATRA组(ATRA 10-7mol·L^(-1))、高糖+中浓度ATRA组(ATRA 10-6mol·L^(-1))、高糖+高浓度ATRA组(ATRA 10-5mol·L^(-1))],Rho激酶抑制药(Y27632)干预组[高糖+Y27632(Y27632为30μmol·L^(-1))],均干预48 h。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞Rho A mRNA、ROCK1 mRNA表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测HK-2细胞白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)变化。结果 RT-PCR结果显示,空白对照组与高渗组Rho A mRNA、ROCK1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);高糖组Rho A mRNA、ROCK1 mRNA表达较空白对照组、高渗组显著升高(P<0.05);ATRA各干预组Rho A mRNA、ROCK1 mRNA表达较高糖组显著减少(P<0.05),且呈现ATRA浓度依赖性;Y27632干预组Rho A mRNA表达与高糖组差异无统计学意义,ROCK1mRNA表达显著减少(P<0.05)。Person直线相关分析显示,高糖组及ATRA干预组Rho A mRNA与ROCK1 mRNA表达呈正相关。ELISA检测结果示空白对照组与高渗组表达IL-6、TNF-α无明显差异(P>0.05);高糖组表达IL-6、TNF-α较空白对照组明显升高(P<0.05);ATRA或Y27632干预后,IL-6、TNF-α表达明显减少(P<0.05)。结论 ATRA可抑制高糖环境下HK-2细胞IL-6、TNF-α表达,其机制可能与抑制Rho A/ROCK信号通路有关。