miR⁃7靶向调控CTSK对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移的影响

【目的】探明miR⁃7与CTSK基因相互作用关系及其对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,为贵州黑山羊优良品种保藏、选育与开发利用提供依据。【方法】采用在线数据库筛选miR⁃7与CTSK基因3′UTR的结合靶点,通过将CTSK基因3′UTR插入双荧光素酶报告系统中进行互作位点检测;采用CCK⁃8和划痕试验检测miR⁃7是否靶向调控CTSK基因影响贵州黑山羊卵巢颗粒细胞的增殖和迁移;过表达miR⁃7后采用RT⁃qPCR检测其对促增殖蛋白PCNA、抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡相关蛋白BAX、caspase⁃3、caspase⁃9表达水平的影响。【结果】成功构建CTSK基因3′⁃UTR 2个预测靶点的野生型和突变型双荧光素酶报告载体;双荧光素酶试验结果表明CTSK基因3′UTR区的2个预测靶位点均受miR⁃7调控;CCK⁃8和细胞划痕结果表明,转染miR⁃7试验组的卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力均显著高于对照(NC)组;RT⁃qPCR结果表明,上调miR⁃7能极显著上调PCNA和BCL2的表达,抑制BAX、caspase⁃3和caspase⁃9的表达。【结论】miR⁃7可以靶向结合CTSK的3′UTR区2个靶位点并极显著抑制CTSK基因的表达;过表达miR⁃7可以显著促进贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力,并促进增殖标志基因、抗凋亡基因的表达和抑制促凋亡相关基因的表达。研究结果可为进一步研究miR⁃7靶向调控CTSK表达影响贵州黑山羊繁殖性能的分子机制提供理论依据。

小鼠CTSK敲降重组腺相关病毒的构建及其功能研究

目的构建小鼠组织蛋白酶K(CTSK)基因的敲降重组腺相关病毒(AAV-shCTSK),检测AAV-shCTSK在小鼠体内的敲降效率,及其对脂肪组织脂质储存的影响。方法设计阴性对照组(NC)及CTSK的shRNA引物,退火后插入到骨架载体中,挑选克隆并测序鉴定,重组质粒经纯化后,利用转染试剂PEI将构建好的腺相关病毒载体、包装质粒和辅助质粒共转染到293T细胞中,进行腺相关病毒包装与扩增,得到AAV-shNC以及AAV-shCTSK。利用脂肪组织原位注射将AAV病毒注射入小鼠附睾脂肪组织,2周后免疫印迹实验检测小鼠脂肪组织中CTSK蛋白的表达量及HE染色检测脂肪组织中脂滴大小。结果成功获得AAV-shNC以及AAV-shCTSK腺相关病毒。原位注射AAV-shCTSK的小鼠脂肪组织中CTSK成功敲降,脂肪组织中白色脂肪细胞显著变小。结论小鼠CTSK的敲降腺相关病毒构建成功,脂肪组织CTSK敲降引起脂肪组织中脂质含量减少。

黔北麻羊CTSK、FN1基因生物信息学分析及其在性腺轴中的表达

【目的】研究组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)和纤维连接蛋白1(Fibronectin 1,FN1)基因与黔北麻羊繁殖率之间的相互关系,为研究CTSK、FN1基因调控山羊卵泡发育的分子机制提供参考。【方法】通过生物信息学方法分析黔北麻羊CTSK、FN1蛋白理化性质、亚细胞定位、信号肽位点和蛋白高级结构,并进行氨基酸同源性分析,构建系统发育进化树;采用荧光定量PCR法检测CTSK、FN1基因在单羔、多羔黔北麻羊性腺轴(下丘脑、垂体、子宫、输卵管、卵巢)中的表达量。【结果】CTSK、FN1基因分别编码330和2478个氨基酸,理论PI值分别为8.82和5.37,CTSK是一种具有信号肽的稳定亲水性蛋白,而FN1是一种具有信号肽的不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位结果说明:CTSK蛋白可能主要在细胞外和内质网中发挥生物学作用,而FN1蛋白可能主要在细胞核中发挥生物学作用;高级结构预测结果显示,CTSK和FN1蛋白均主要由无规则卷曲构成;与其他动物相比,黔北麻羊CTSK、FN1基因均与反刍动物绵羊及牛的亲缘关系最近。qPCR分析表明:CTSK和FN1基因在单羔、多羔黔北麻羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢组织中均有表达,与单羔组相比,多羔组CTSK基因在卵巢、下丘脑、子宫中的表达量均极显著下调(P<0.01),而FN1基因在下丘脑和子宫中的表达均极显著上调(P<0.01),在卵巢中显著上调(P<0.05)。【结论】CTSK基因表达量与黔北麻羊的繁殖性状呈负相关,FN1基因则呈正相关,CTSK和FN1基因均是影响黔北麻羊繁殖性能的重要候选基因。

调控CTSK基因的候选miRNA在单羔、多羔贵州黑山羊卵巢和子宫体的表达分析

以贵州黑山羊为研究对象,通过生物在线软件预测调控CTSK基因表达的候选miRNAs,采用荧光定量PCR法检测CTSK及其候选miRNAs在贵州黑山羊单、多羔性腺轴下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫体及子宫角6种组织中的表达量。结果:CTSK在单、多羔贵州黑山羊的6个组织中均有表达,在单羔组中表达量依次为子宫角>输卵管>卵巢>子宫体>垂体>下丘脑,其中在子宫角中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在多羔组中,其表达量依次为子宫体>输卵管>子宫角>卵巢>垂体>下丘脑,其中子宫体的表达量显著高于其他组织(P<0.05);组间比较可知,CTSK基因在多羔组子宫体中的表达量极显著高于单羔组(P<0.01),卵巢中的表达量极显著低于单羔组(P<0.01)。在线软件预测结果表明:miR-122、miR-205、miR-7、miR-30-5p和miR-124为调控CTSK表达评分最高的5条miRNAs。qPCR结果表明:5条miRNAs在子宫体和卵巢中均有表达,在子宫体中,单羔组和多羔组的表达量均依次为miR-122>miR-30-5p>miR-205>miR-7>miR-124,其中miR-122的表达量显著高于其他miRNAs(P<0.05);组间比较显示,单羔组中miR-122、miR-30-5p、miR-205和miR-124表达量极显著高于多羔组(P<0.01),而miR-7表达量显著高于多羔组(P<0.05)。在卵巢组织中,5条miRNAs在单羔组中的表达量依次为miR-30-5p>miR-122>miR-205>miR-7>miR-124,其中miR-30-5p的表达量显著高于其他miRNAs(P<0.05),在多羔组中,其表达量依次为miR-122>miR-30-5p>miR-7>miR-205>miR-124,其中miR-122的表达量显著高于其他miRNAs(P<0.05),而miR-124表达量最低;组间比较可知,miR-7在多羔组中极显著高于单羔组(P<0.01),而miR-30-5p在多羔组中极显著低于单羔组(P<0.01)。本研究解析了CTSK基因在贵州黑山羊性腺轴上的表达情况,筛选到5条调控CTSK表达的候选miRNAs,弄清了5条miRNAs在贵州黑山羊子宫体和卵巢组织上的表达谱,为进一步阐明miRNA调控CTSK基因影响山羊繁殖率的分子机制奠定基础。

广西巴马小型猪CTSK基因CDS区克隆与生物信息学分析

目的对广西巴马小型猪组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)基因CDS区进行克隆及生物信息学分析。方法从广西巴马小猪的皮下脂肪中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增获得CTSK基因CDS区序列,并采用相关生物信息学软件对其序列特征、系统进化、编码蛋白结构和理化性质进行分析。结果广西巴马小型猪CTSK基因CDS全长993 bp,编码330个氨基酸,与NCBI上公布的普通猪(NM_214302.1)CTSK基因序列完全一致。同源性比对结果发现,CTSK基因在进化过程中具有较高的保守性。广西巴马小型猪CTSK蛋白具有明显的亲水性区域,在第17-330氨基酸位置区域存在一条信号肽序列,不存在跨膜结构域,二级结构元件由α螺旋、β折叠、无规卷曲和延伸链组成。修饰结构预测发现CTSK蛋白存在两处N糖基化位点,亚细胞定位发现其可能主要分布于内质网和细胞核。结论本研究成功克隆了广西巴马小型猪CTSK基因CDS序列并进行分析,为今后进一步深入研究该基因功能和建立相关疾病动物模型提供理论基础。

龟板联合阿伦磷酸钠对激素性骨质疏松大鼠腰椎Runx2、CTSK表达的影响

目的:观察龟板联合阿伦磷酸钠(ALN)对激素性骨质疏松(GIOP)大鼠腰椎Runx2、CTSK表达的影响。方法:40只3月龄雌性SD大鼠随机分为4组:空白组、模型组、ALN组、龟板联合ALN组(联合组)。模型组、ALN组及联合组皮下注射地塞米松造模,成功后分别用0.9%氯化钠溶液、ALN和龟板联合ALN进行灌胃。12周后取大鼠腰椎进行:micro-CT检测腰椎骨微细结构、HE染色观察骨组织形态学,qPCR及Western blot分别检测腰椎Runx2、CTSK mRNA和蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组Tb.N、Tb.Th明显下降(P<0.01),Tb.Sp、CTSK mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01),Runx2 mRNA和蛋白表达呈下调趋势;与模型组比较,ALN组和联合组BS/TV、Tb.N、Tb.Th、Runx2蛋白表达明显升高(P<0.01),Tb.Sp、CTSK mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论:龟板联合阿伦磷酸钠抗大鼠腰椎GIOP的协同机制可能与调节Runx2、CTSK的表达密切相关。

HIF-1α通过调控H型血管生成参与牙周炎的发展

目的 探讨在牙周炎微环境中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和H型血管是否参与牙周炎-牙槽骨吸收过程。方法 将10只C57BL/6小鼠随机分为牙周炎组和对照组,每组5只;牙周炎组采用5-0丝线结扎C57BL/6小鼠双侧上颌第二磨牙,建立小鼠实验性牙周炎模型;对照组不予处理。结扎14 d后micro-CT检测小鼠上颌第二磨牙牙槽骨高度的变化,免疫组化实验分析牙周炎牙槽骨缺损处组织蛋白酶K(CTSK)的表达情况,免疫荧光法分析牙周组织中H型血管(CD31+Emcn+)及HIF-1α的表达。结果 采用丝线结扎法成功构建小鼠牙周炎模型。micro-CT扫描结果示,与对照组相比,牙周炎组小鼠釉牙骨质界(CEJ)距牙槽嵴顶(ABC)的距离(CEJ-ABC)显著增加(P<0.001);HE染色结果显示,牙周炎组出现较重炎症病理性反应。免疫组化结果显示,牙周炎组牙槽骨中CTSK的表达水平相较对照组更高(P<0.05)。免疫荧光结果显示,与对照组相比,牙周炎组牙周组织中HIF-1α表达水平提高(P<0.000 1),H型血管生成增加,即CD31+Emcn+的表达更高(P<0.001)。结论 通过丝线结扎成功建立小鼠牙周炎模型,小鼠牙周炎牙周组织中HIF-1α和H型血管特异性升高,提示在牙周炎早期的缺氧微环境中,HIF-1α和H型血管参与牙周炎牙槽骨的骨吸收过程。

艾司氯胺酮对破骨细胞分化的影响

目的研究艾司氯胺酮在体外对核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化的影响及机制。方法从C57BL/6小鼠骨髓中分离获得骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophages colony-stimulating factor,M-CSF)和RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度艾司氯胺酮(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100,200μmol/L)分别作用0,24,48,72 h对BMMs的毒性作用,并筛选出合适浓度,然后将诱导分化的破骨细胞分为3组:对照组、RANKL组和RANKL+艾司氯胺酮组。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察艾司氯胺酮对破骨细胞分化的影响;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测艾司氯胺酮对破骨细胞分化相关基因NFATc1、c-Fos和CTSK mRNA表达水平的影响。结果CCK-8检测结果显示,艾司氯胺酮在0~200μmol/L对BMMs无明显的毒性作用(P>0.05)。TRAP染色结果显示,与对照组比较,RANKL组和RANKL+艾司氯胺酮组中TRAP染色阳性的破骨细胞数量增加(P<0.01);与RANKL组比较,RANKL+艾司氯胺酮组中TRAP染色阳性的破骨细胞数量减少(P<0.01)。qRT-PCR检测结果显示,与对照组比较,RANKL组NFATc1、c-Fos和CTSK mRNA表达升高(P<0.01);与RANKL组比较,RANKL+艾司氯胺酮组NFATc1、c-Fos和CTSK mRNA表达降低(P<0.01)。结论艾司氯胺酮可抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,其机制可能与艾司氯胺酮抑制破骨细胞分化过程中特异性基因NFATc1、c-Fos、CTSK mRNA的表达水平有关。

汉防己甲素诱导自噬抑制破骨细胞的分化

背景:已有研究表明汉防己甲素可以通过激活AMPK信号通路诱导细胞自噬从而抑制肿瘤细胞增殖,但目前汉防己甲素诱导破骨细胞自噬和分化的相关研究甚少。目的:探究汉防己甲素在不同浓度下对破骨细胞分化和自噬的影响,并分析诱导破骨细胞自噬能否起到抑制其分化的作用。方法:(1)第一部分:使用重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体两种细胞因子对小鼠RAW264.7巨噬细胞进行诱导,使其向破骨细胞转化。细胞诱导及药物干预分组如下:空白对照组(完全培养基),阳性对照组(含两种细胞因子),低、中、高剂量汉防己甲素干预组(阳性对照组分别添加0.1,0.5,1.0μmol/L汉防己甲素)。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测组织蛋白酶K(CTSK)、自噬微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和自噬底物泛素结合蛋白(p62)的蛋白相对表达量;RT-PCR检测CTSK、LC3-Ⅱ和p62的mRNA相对表达量;丹酰尸胺(MDC)染色观察诱导过程中破骨细胞中自噬小体的数量变化。(2)第二部分:选取抑制破骨细分化效果最明显的汉防己甲素浓度(1.0μmol/L)进行回复性验证。各组处理如下:阳性对照组(含两种细胞因子),自噬抑制剂组(巴佛洛霉素处理),药物干预组(汉防己甲素干预),药物干预+自噬抑制剂组。抗酒石酸酸性磷酸酶染色法观察成熟破骨细胞数量变化;Western blot法检测CTSK的蛋白相对表达量。结果与结论:(1)一定浓度汉防己甲素能够对破骨细胞的分化起抑制作用,并且抑制作用随药物浓度升高而提升;(2)汉防己甲素在一定浓度下能够激发破骨细胞分化过程中自噬标志物的表达及减少自噬特异性底物累积,并在破骨细胞分化过程中可刺激自噬小体形成;(3)使用自噬抑制剂后,汉防己甲素抑制破骨细胞分化的作用受到显著影响;(4)综上,一定浓度的汉防己甲素能够通过激活自噬抑制破骨细胞的分化。

双荧光标记小鼠模型研究破骨细胞融合

目的利用双荧光标记小鼠模型观察破骨细胞的融合过程并探讨不同浓度的细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和甲状旁腺激素(PTH)对破骨细胞融合效率的影响。方法使用5周龄CTSK-Cre和的ROSAmt/mg两种转基因小鼠,前者无荧光表达而在其破骨细胞中表达CRE重组酶,后者表达红色荧光(tomato)。处死两种小鼠并冲出骨髓间充质干细胞(BMSCs)且以1∶1的比例混合培养。将不同浓度的RANKL和PTH加入共培养体系,计算绿色荧光的量。结果 CTSKCre和ROSAmt/mg2种转基因小鼠BMSCs共培养第5天观察到绿色荧光阳性的细胞出现;RANKL组:随着RANKL浓度的升高,共培养体系内绿色荧光阳性的细胞数不断增加;PTH组:共培养体系内绿色荧光阳性的细胞数与PTH浓度之间未发现明显的相关性。结论基于cre-loxp系统建立的cre重组酶诱导的双荧光标记小鼠模型可有效用于破骨细胞融合过程的研究;RANKL的浓度越高其诱导破骨细胞融合的效率越高;PTH与破骨细胞的融合效率之间无明显的剂量相关规律。

基于Blimp1/Bcl6通路探讨骨痛灵联合唑来膦酸治疗肺癌骨转移的实验研究

目的观察骨痛灵方对肺癌骨转移疼痛模型小鼠Blimp1/Bcl6通路的影响。方法 85只C57 BL/6小鼠随机选取17只小鼠,注射PBS溶液作为假手术组;其余68只小鼠左后肢胫骨骨髓腔内注射Lewis肺癌细胞建立骨转移疼痛模型,随机分为模型组、中药组、西药组、中西药组,每组17只。中药组小鼠以骨痛灵方煎剂灌胃,西药组予以唑来膦酸腹腔注射,中西药组则两药联合运用,治疗3周。采用TRAP特殊染色法检测小鼠胫骨的破骨细胞,以RT-PCR和Western blot法检测B细胞诱导成熟蛋白1(Blimp1)、B细胞淋巴瘤蛋白6(Bcl6)和组织蛋白酶K(Ctsk) mRNA和蛋白的表达。结果与模型组比较,中药组、西药组和中西药组TRAP阳性细胞数量均明显减少,Blimp1、Ctsk mRNA和蛋白表达均降低,Bcl6 mRNA和蛋白表达均升高,且差异均有统计学意义(P<0.05);在3个治疗组中,中西药组阳性细胞数量最少,Blimp1、Ctsk mRNA和蛋白表达最低,Bcl6 mRNA和蛋白表达最高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨痛灵方通过抑制Blimp1/Bcl6通路,抑制破骨细胞的活化,从而缓解肺癌骨转移疼痛。

血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b和组织蛋白酶K随年龄及绝经变化的分析

目的调查西南地区不同年龄组健康女性抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)、组织蛋白酶K(CTSK)的总体趋势和分布情况,并确定绝经状态对二者的影响。方法共研究了2125名女性[包括绝经前(n=1557)和绝经后(n=568)妇女,年龄分别为20～79岁]。所有纳入研究的女性均在标准化条件下采集静脉血样,并采用ELISA法测定血清中TRACP-5b和CTSK含量,通过双能X射线吸收测定法测定腰椎(L_1-L_4)和股骨颈的骨密度(BMD)值。结果随着年龄的增加,TRACP-5b、CTSK发生适度变化,均逐渐增加,并且在60岁以后TRACP-5b和CTSK水平均保持稳定。与绝经前妇女相比,绝经后妇女的血清TRACP-5b、CTSK、完整PTH均显著增加(P<0.05),而Mg水平均显著降低(P<0.05)。与绝经前相比,不同绝经年限妇女的TRACP-5b、CTSK水平均显著增加(P<0.05)。逐步多元线性回归分析发现,年龄、BMI、FSH、LH和PTH是TRACP-5b的影响因素,CTSK的影响因素包括年龄、BMI、FSH、LH和PTH。结论建立的TRACP-5b、CTSK参考区间值有助于在很长时期内评估该西南地区妇女骨转换情况。

JAG2基因沉默影响大肠癌细胞株侵袭能力的研究

目的 Notch信号在肠上皮细胞种系分化和引发肠腺瘤和肠癌中起着关键的作用。本文试图探讨Notch信号的配体JAG2在大肠癌中的作用。方法 Real-Time PCR和Western blot分别检测JAG2特异性si RNA对JAG2 m RNA及蛋白表达的抑制率,细胞增殖实验和细胞侵袭实验观察si RNA对细胞增殖及侵袭能力的影响,人类肿瘤转移RT2 Profiler?PCR Array用于筛选JAG2下游靶基因,并应用特异性抑制化合物抑制靶蛋白活性。结果特异性si RNA对JAG2 m RNA及蛋白的表达具有抑制作用(P<0.05),对细胞增殖无明显影响(P>0.05),对细胞侵袭能力明显抑制(P<0.05),而组织蛋白K(CTSK)活性降低可能参与了这一过程。结论 JAG2基因可能对大肠癌细胞的侵袭转移能力起促进作用。