基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

跨越式滚环等温扩增试剂盒检测沙门氏菌的研究

沙门氏菌可引起食源性疾病,严重危害食品安全和人类健康。因此,开发新的检测方法尤为重要。本研究基于自主研发的新型核酸扩增方法--跨越式滚环等温扩增,研制了检测沙门氏菌的试剂盒,并对该试剂盒相关性能进行评估。结果显示,试剂盒检测沙门氏菌的特异性良好,灵敏度为4.1×10^(1)CFU·mL^(-1),有效期可达90 d,表明该试剂盒可靠、灵敏、稳定,可满足食品中沙门氏菌快速检测的需求。

国产化Y-STR试剂盒与YFiler^(TM) Platinum PCR扩增试剂盒的法医DNA检验性能比较研究

该文评估4种国产化Y-STR试剂盒与Yfiler^(TM) Platinum PCR扩增试剂盒的法医DNA检验性能,并进行比较分析。结果显示,4种国产化Y-STR试剂盒均可基本满足日常案件检测需要,在灵敏度和拮抗抑制剂的适用性的方面,SureID■ Y40 PCR扩增试剂盒和炎黄Y数据分型盒表现较优,在降解样本的适用性方面,Yfiler^(TM) Platinum PCR扩增试剂盒和国产化炎黄Y数据分型盒表现最优。

牛支原体等温扩增冻干试剂盒研究

【目的】牛支原体(Mycoplasma bovis)是导致牛多种疾病综合征的病原体之一,在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况,迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞,获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后,获得质粒浓度为10~4拷贝/μL的溶液,作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液(主成份为SYBR Green I和HNB),分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术的基础上配制等温扩增试剂,并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂,每种保护剂分别选用3种不同的浓度,共设计27种保护剂组方,通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂,放到冻干机中测定共晶点,并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定,筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液,组装成试剂盒。利用6个浓度梯度(10~0-10~5个拷贝)重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性,利用浓度为10~4 CCU·mL^(-1)的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10~8CCU·mL^(-1)的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10~8CFU·mL^(-1)的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌,检测试剂盒的特异性。另外,将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存,检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白不影响等温扩增反应,在此基础上优选的冻干保护剂配方为5%海藻糖+1.25%甘露醇+1.25%牛血清白蛋白,等温扩增试剂共晶点为-16℃,一次干燥的升温时间3h,一次干燥时间6h,二次干燥时间4 h。组装后的试剂盒最低可检测到10个拷贝数的重组质粒,检验PG45株、HB-1株以及SD-2株牛支原体均为阳性,检验牛鼻支原体、无乳支原体、多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌均为阴性。试剂盒在20℃保存6个月、37℃保存10 d后,敏感性仍为10个拷贝数,与第0天相同,推测4℃保存有效期为24个月左右。【结论】笔者研制的等温扩增冻干试剂盒敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷,适合基层兽医现场检测使用。

华夏^(TM)白金PCR扩增试剂盒的法医学应用评估

目的调查华夏^(TM)白金PCR扩增试剂盒所包含的23个常染色体STR基因座在中国汉族人群中的遗传多态性,评估其在法医遗传学中的应用价值。方法应用华夏^(TM)白金PCR扩增试剂盒对500名汉族无关健康个体进行分型检测,统计分析所含STR基因座的频率分布及群体遗传学参数,与目前国内外常用的7种商品化试剂盒在STR基因座个数、内标、荧光标记、Ladder中等位基因总数以及系统效能上进行比较。结果 23个常染色体STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),个体识别率为0.791 5~0.986 2,多态信息含量为0.559 0~0.914 0。系统累积个体识别率高达1-4.1×10-28,三联体累积非父排除率为1-4.1×10^(-10),二联体累积非父排除率为1-8.4×10^(-7)。通过与7种试剂盒比较,华夏^(TM)白金PCR扩增试剂盒含有的等位基因分型标准品(Ladder)中的等位基因数最多。结论 23个常染色体STR基因座在汉族人群中有良好的遗传多态性,可用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。通过与其他常见的7种商业化STR检测试剂盒比较,华夏^(TM)白金PCR扩增试剂盒可进一步提供更为丰富的遗传信息。

3种常用PCR扩增试剂盒检验血样DNA的结果比较

目的探讨常用的ProfilerPlusTM、IdentifilerTM与Powerplex(16试剂盒检验血样DNA的差异。方法510名无关中国汉族个体血样,分别用ProfilerPlusTM与Powerplex(16试剂盒进行DNA检验,然后对有不同检验结果的同一样本,再用ProfilerPlusTM、IdentifilerTM与Powerplex(16等三种试剂盒进行检验,并比较其结果。结果在510名个体血样的DNA检测结果中,发现同一样本有不同结果的有7例,其差异率为1.3725%;ProfilerPlusTM、IdentifilerTM与Powerplex(16各有1例在D13S317或FGA基因座上出现等位基因缺失现象,缺失率为0.1961%;ProfilerPlusTM有5例在D8S1179基因座上出现扩增严重不平衡现象,相应的IdentifilerTM与Powerplex(16试剂盒的检验结果为正常杂合子。结论ProfilerPlusTM、IdentifilerTM与Powerplex(16试剂盒检验血样DNA均会出现扩增不平衡和/或基因丢失现象,其发生几率IdentifilerTM与Powerplex(16试剂盒较ProfilerPlusTM少。

布鲁菌环介导等温扩增检测试剂盒的研制

利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立布鲁菌的检测方法。通过对反应条件的优化,组装布鲁菌LAMP检测试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。结果显示,该试剂盒适用于布鲁菌的快速检测,在63℃条件下1h内可检出布鲁菌,其检测限达5copies/μL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。反复冻融20次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果。对牛奶样品的检测结果显示,阳性检出率为3.33%,与奶牛布鲁菌病PCR诊断技术(NY/T1467-2007)的检测结果相符。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。

不同PCR扩增试剂盒检验血样DNA的结果对比分析

目的分析检验血样DNA时选用不同的PCR扩增试剂盒的结果对比。方法在检验490例血样DNA时选用不同的试剂盒(Powerplex@16、Profiler Plus),并对检验数据进行标记,分别为A类、B类,对结果进行分析对比。结果相同样本存在检验差异的百分比为1.224%(6/490),A类与B类均存在等位基因缺失,异常基因位置分别为FGA和D13,缺失百分比均为0.408%;B类中存在扩增不平衡,异常基因位置为D8,不平衡百分比为0.612%,在此相同的基因位置A类表示为正常杂合子。结论在检验血样DNA时选用不同的试剂盒会出现不同位置的异常基因,表现为基因缺失或扩增不平衡,相较之下,Profiler Plus出现异常的百分比更高。

博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高。方法通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、TritonX-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。结果在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6 mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5 mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8 mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与TaKaRa PCR buffer的对比中,TBTT buffer效果明显好于后者。结论 成功研制优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液。

DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒在案件中的应用研究

本文探讨DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒在案件中应用的可行性。应用DNATyper mtDNASNP60^(TM)试剂盒对100个汉族无关个体和20组全同胞进行mtDNA SNP检验;取25 pg/μL马、牛、羊、猪、鸡、鸭、猫、狗、兔、鼠和大肠杆菌的DNA样品进行种属特异性测试;取5、10、20、40μmol/L血红素进行抗抑制性测试;取两个批次的DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒经反复冻融10次后进行稳定性测试;分别应用VeriFiler^(TM)Plus PCR扩增试剂盒和DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒对100份陈旧、腐败、降解检材进行检验。结果表明,100个汉族无关个体均获得清晰的mtDNA SNP分型结果,其检验结果与通过mtDNA测序获得的结果完全一致;100个汉族无关个体含有100种不同的单倍型;20组全同胞中每组个体之间mtDNA SNP分型结果相同;DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒对马、牛、羊、猪、鸡、鸭、猫、狗、兔、鼠和大肠杆菌的DNA样品进行检测,均未出现特异性分型;当血红素浓度≤40μmol/L时,所有mtDNA SNP位点均获得正确分型;两个批次的DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒经反复冻融10次后,所有mtDNA SNP位点均可正确分型;对于100份陈旧、腐败、降解检材,STR检出率为55%,mtDNA SNP的检出率为86%,mtDNA SNP的检出率显著高于STR。当模板DNA浓度大于5 pg/μL时,DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒能得到完整的分型谱图。综上,DNATyper mtDNA-SNP60^(TM)试剂盒可应用于陈旧、腐败、降解检材的检验,具有很好的实战应用价值。

不同PCR扩增试剂盒检验血样DNA的检验结果对比研究

目的:讨论研究Profiler PlusTM、IdentifilerTM以及Powerplex16扩增试剂盒用于检验血样DNA检验结果的差异,并研究其扩张不平衡和基因丢失现象的发生几率。方法:选取150例完全无血缘关系的个体作为研究对象并采集其血样,分别使用两种扩增试剂盒进行检验。对所得不同结果的同一对象再使用3种扩增试剂盒进行检验。将检验所得结果进行比较。结果:3种试剂盒检测的等位基因缺失率比较差异无统计学意义(P>0.05)。Profiler PlusTM检测扩张不平衡率显著高于其余两种试剂盒(P<0.05)。结论:使用PCR扩增试剂盒对血样DNA进行检测时,会出现不同位置的异常基因,可表现为基因缺失及扩增不平衡。但Profiler PlusTM检验扩增不平衡发生率显著高于其余两种试剂盒。在实际生活对血样DNA进行检测时,除需准备主要检测扩增试剂盒外,还需准备其他不同类备用试剂盒用于互相验证及对比,尽量降低基因等位缺失及扩张不平衡发生率。

华夏^TM白金PCR扩增试剂盒的法医学验证及STR遗传多态性调查

目的测试华夏^TM白金PCR扩增试剂盒的技术性能和指标,并对山东地区汉族群体遗传多态性进行调查。方法从种属特异性、灵敏度、适应性、稳定性、均衡性及混合样本与抑制剂等方面对试剂盒进行验证,并对山东地区的汉族人群383名无关个体进行DNA扩增分型检验。结果华夏TM白金PCR扩增试剂盒具有种属特异性,灵敏度高,适应性、均衡性好,对混合样本及含抑制剂样品具有一定的检测分析能力。23个常染色体STR基因座基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡,杂合度(heterozygosity,H)在0.627~0.930,个体识别能力(discrimination power,DP)在0.783~0.986,非父排除率(power of exclusion,PE)在0.324~0.856,多态信息含量(polymorphism information content,PIC)在0.551~0.916,累积个体识别能力(cumulative probability of discrimination,CDP)为0.999999999999999999999999998319,累积非父排除率(cumulative probability of exclusion,CPE)为0.999999999596233。结论华夏^TM白金PCR扩增试剂盒具有较高的多态信息含量,对群体遗传学研究及法医学应用具有重要价值。

GlobalFiler~PCR扩增试剂盒验证及其STR遗传多态性

目的：测试GlobalFiler PCR扩增试剂盒技术性能指标，评估其法医学应用价值，并对其遗传多态性进行调查。方法从灵敏度、混合样本、种属特异性、适应性、耐受性、一致性、均衡性、稳定性8个方面对该试剂盒进行测试，自动工作站提取北京地区汉族人群373名无关个体血样DNA进行扩增检测。结果GlobalFiler PCR扩增试剂盒灵敏度较高，对混合、酶切降解和含抑制剂样品具有一定的检测分析能力，适应性和均衡性较好。21个STR基因座基因型频率分布均符合Hardy－Weinberg 平衡（P＞0．05），PIC 值在0．536～0．940，H值在0．558～0．933，DP值在0．783～0．992，PE值在0．243～0．874。结论 GlobalFiler PCR 扩增试剂盒可用于法庭科学实际检案与建库，21个STR基因座在北京汉族人群中具有较高的遗传多态性，对法医学应用和群体遗传学研究具有重要意义。

丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒核酸扩增荧光检测试剂盒在血液筛查中的敏感性

目的 评价深圳匹基公司开发的HCV和HIV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒在血液筛查中的灵敏度和检测极限。方法 以阴性血浆梯度稀释WHO的HCV及HIV标准品,病毒稀释液滴度分别为200、100、50、25和0 IU/ml,每个满度平行做24个重复,利用该试剂盒及检测方案测定各滴度的 HCV和 HIV的24个重复的检出例数和阳性率(检测阳性例数/总重复数)。结果 滴度≥50IU/ml的HCV检出率为100％(24/24),而25IU/ml为75％(18/24)。滴度≥100IU/ml的HIV检出率为100％(24/24),50IU/ml为92％(22/24)。结论 匹基公司开发的HCV和HIV核酸扩增荧光检测试剂盒在特异性和灵敏度方面已经达到核酸检测(Nucleic Acid Test,NAT)的要求,基本达到国际同类试剂的检测水平。

19种扩增试剂盒的确证试验

目的测试11种国产试剂盒(包含DNATyperTM15、Goldeneye16A、Goldeneye16BT、Goldeneye16C、Goldeneye20A、Goldeneye BASIC、AGCU17+1、AGCU Expressmarker16、AGCU Expressmarker22、AGCU Expressmarker20、STRtyper-21G)和8种进口试剂盒(包含Identifiler、ID-Direct、ID-Plus、Sinofiler、Power Plex16、Power PTheselex16HS、Power Plex18D、Power Plex21)的技术性能指标,评估其法医学应用能力,并对各种试剂盒进行分析比较。方法制定测试方案,从方法学、准确性、均衡性、灵敏度、批次间试剂的稳定性、耐受性、适应性与一致性、种属特异性、混合样本、不同反应体系的适应性等10个方面进行测试。结果阳性DNA样本分型正确,内标和等位基因分型标准物符合要求;等位基因间、同一荧光标记基因座间及不同标记物间的均衡性较好;试剂盒使用说明书中推荐的最小DNA模板量的阳性DNA样本均能检出全部STR基因座分型;不同批次间和反复冻融后试剂盒测试可以获得正确分型;对降解检材和混有抑制剂的样本等具有一定的耐受性;能对案件中多种检材进行分型且分型结果一致;各种试剂盒均具有种属特异性和混合DNA样本检测的能力;各种试剂盒在扩增体系为25μL、10μL时均可以得到完整的DNA分型。结论所检测试剂盒在上述性能指标等方面已经达到国际同类产品的技术水平,可用于法庭科学的实际检案与建库。

几种常用PCR扩增试剂盒检验血样DNA的结果比较

目的探讨Profiler PlusTM、IdentifilerTM与Powerplex 16HS3种试剂盒对检验血样DNA的结果,探讨3种方法的扩增不平衡和/或基因丢失现象发生机率。方法选取600名无血缘关系的中国汉族个体为研究对象,采其血样,先用其中2种试剂盒对600份血样进行DNA检验,选出出现不同检验结果的标本,再分别用3种试剂盒对以上具有不同结果的同一样本进行检验,比较检验结果,观察3种试剂盒扩增不平衡和/或基因丢失现象的发生机率。结果 600份血液样本的检验差异率为1.333%;用3种试剂盒分别对以上8份样本进行DNA检验,等位基因缺失发生率均为0.1667%;Profiler PlusTM、IdentifilerTM与Powerplex 16HS3种试剂盒的扩增不平衡的发生率分别为1.167%、0.1667%和0.1667%。结论 3种试剂盒在检验血样DNA时均会出现等位基因缺失和扩增不平衡现象,等位基因缺失的发生率之间无统计学差异,但Profiler PlusTM试剂盒扩增不平衡的发生率较另外2种较高,具有统计学差异。在实际工作中,在使用一种主要试剂盒的同时,还应注意备用其他试剂盒作为相互验证之用,减少因等位基因缺失和扩增不平衡带来的误差。