鸡猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的分子检测

为了解河南地区鸡猪源CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的流行情况,并进行基因型分析,通过表型确证试验检测产ESBLs大肠杆菌,分别用5组CTX-M型引物对其进行聚合酶链式反应扩增。表型确证试验检测结果显示,鸡、猪源大肠杆菌中产ESBLs菌株检出率分别为62.8%(59/94)和78.3%(36/46)。PCR扩增结果进一步显示,鸡源大肠杆菌中CTX-M型ESBLs阳性率为89.8%(53/59),其中CTX-M-2组型14株,CTX-M-9组型26株,CTX-M-2和CTX-M-9组型13株;猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的阳性检出率为69.4%(25/36),其中,CTX-M-2组型7株,CTX-M-9组型17株,CTX-M-2和CTX-M-9组型1株。河南地区鸡、猪源大肠杆菌CTX-M型ESBLs的产生率较高,而以CTX-M-2组型和CTX-M-9组型为主。

1084例女性TRACP、CTX-1、BALP、BGP、钙磷代谢指标与BMD相关性

目的研究女性抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、I型胶原交联C-末端肽（CTX-1）、骨碱性磷酸酶（BALP）、骨钙素（BGP）、25-羟维生素D3（25（OH）D3）、甲状旁腺素（PTH）、降钙素（CT）与股骨颈BMD的相关性。方法采用DiscoveuWA型骨密度仪检测股骨颈BMD，采用酶标免疫分析仪检测TRACP、CTX-1、BALP、BGP、25（OH）D3、PTH、CT。将1084例受试者检测结果按5岁为年龄段分组，应用SPSS13．0分析软件进行统计分析。结果25（OH）D3、PTH、CT在35-50岁年龄段各组间不存在差异；50岁以后25（OH）D，开始下降，与BMD呈正相关；CT降低出现在65-79岁年龄段，与BMD显著正相关。35-45岁年龄段TRACP、CTX-1与BMD呈负相关，而BALP、BGP与BMD呈正相关；50-60岁年龄段BALP、BGP明显升高，TRACP、CTX-1、BALP、BGP均与BMD呈负相关；65岁以后BALP、BGP开始下降，BALP、BGP与骨密度呈正相关，TRACP、CTX-1与骨密度呈负相关。结论TRACP、CTX-1、BALP、BGP、25（OH）D3、PTH、CT监测骨代谢水平为骨质疏松诊断、鉴别诊断提供了分子生物学依据。

CTX-M酶在北京协和医院临床分离大肠埃希菌中的流行

目的了解北京协和医院临床分离产ESBLs大肠埃希菌的耐药性及所产ESBLs的等电点和基因型特征。方法对2002年11-12月间北京协和医院临床分离的22株产ESBLS大肠埃希菌采用琼脂平皿对倍稀释法测9种抗菌药的MIC；接合试验研究ESBLs基因是否定位于质粒，并对接合于进行MIC测定和ESBLs确证；等电聚焦电泳检测各菌株及其接合子所产B内酰胺酶的等电点；以PCR通用引物对接合子扩增blaTEM，blaSHV，blaCTX-M基因后测序以确定基因亚型。结果产ESBLs的22株大肠埃希菌仅1株（4．5％）对头孢噻肟敏感，远低于对头孢他啶的敏感率（86．4％，19株），对氨曲南，头孢吡肟，头孢哌酮-舒巴坦，头孢米诺，亚胺培南的敏感率从50％～100％，对环丙沙星和加替沙星的敏感率均较低（9．1％和22．7％）。接合实验获得16株接合子，所有接合子均确证产ESBLs，接合子对上述7种β内酰胺类药物的药敏谱与供体菌相似，而对环丙沙星和加替沙星则全部敏感。接合子和供体菌所产的β内酰胺酶等电点主要为5．4，7．6和8．2，且这些酶均能被克拉维酸抑制。8株接合子扩增出blaTEM基因，将其中1株测序发现其与blaTEM1（GenBank accession no．AY293072）100％同源；3株接合子扩增出blaCTX-M-3组基因，将1株测序发现其与blaCTX-M-3（GenBank accession no．AY485338）100％同源；13株接合子扩增出blaCTX-M-14组基因，将1株测序发现其与blaCTX-M-14（GenBank accession no．AF462398）100％同源。16株接合子均未扩增出blaSHV基因和blaCTX-M-5组基因。结论我院2002年11-12月间产ESBLs的大肠埃希菌中有TEM及CTX-M酶的流行，这些酶特别是CTX—M酶的存在导致大肠埃希菌对大多数口内酰胺类药物耐药，对头孢噻肟高度耐药尤为明显。

血清P1NP、β-CTX检测在老年乳腺癌骨转移诊断中的价值

目的探讨血清Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)和β-I型胶原羧基端肽(β-CTX)在乳腺癌骨转移监测中的意义。方法 88例乳腺癌患者分为乳腺癌骨转移组48例,无骨转移组40例,健康体检者40例为正常对照组,用电化学发光免疫分析检测血清P1NP和β-CTX水平。结果乳腺癌骨转移组的血清P1NP明显低于无骨转移组及正常对照组(均P<0.05),而血清β-CTX明显高于无骨转移组及正常对照组(均P<0.05);乳腺癌骨转移患者P1NP与β-CTX呈负相关(r=-0.677,P<0.05)。结论血清P1NP和β-CTX对乳腺癌患者骨转移的早期诊断有一定的价值。

O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXФ的诱导及转染性研究

目的 探讨新出现的O139群霍乱弧菌中溶原性噬菌体CTXΦ的来源及其是否可产生感染性的噬菌体颗粒 ,从而造成毒素基因的水平转移。方法 用DNA破坏剂丝裂霉素C诱导噬菌体CTXΦ基因组被四环素抗性基因标记的O139菌株BJ30 ,继而体外转染古典型标准菌株 5 6 9B和O395 ,对获得的四环素抗性的转导菌株进行转染噬菌体基因组的鉴定。结果 序列同源性分析表明 ,BJ30菌株中的rstR基因与O1群ElTor型菌株的rstR基因完全一致 ;丝裂霉素C诱导获得了感染性噬菌体颗粒 (CTX TcΦ) ,并成功感染O1群霍乱弧菌 5 6 9B和O395 ,转染率分别为 1.0 4× 10 - 4 和 3.2 7× 10 - 6 。结论 O139群霍乱弧菌能产生感染性CTXΦ颗粒 ,ElTor型菌株不是产生CTXΦ的唯一来源。

CTX-M型超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌的分子流行病学研究

目的了解湖北地区产CTX-M型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的流行基因型,为有效预防和控制该类感染提供理论依据。方法临床分离的无重复产ESBLs的肺炎克雷伯菌70株,采用NCCLS表型筛选和确证试验检测ESBLs,采用聚合酶链反应(PCR)检测CTX-M基因型,并采用PCR-RFLP检测blaCTX-M基因分型,质粒接合试验探讨产CTX-M型ESBLs菌株的传播机制。结果70株产ESBLs的肺炎克雷伯菌中,产CTX-M基因型的肺炎克雷伯菌有26株(37%),PCR-RFLP及DNA测序证实其均为CTX-M-1亚组,其中CTX-M-3型最常见,质粒接合试验证实CTX-M型ES-BLs介导的耐药可以水平转移。结论湖北地区存在着CTX-M基因的流行,且产CTX-M型ESBLs菌株的传播机制以质粒介导的为主,可以水平传播,应加强湖北地区产CTX-M型ESBLs菌株的分子流行病学检测。

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株CTX-M型耐药基因的初步分布

目的 了解 1999～ 2 0 0 0年合肥市多所医院临床分离的产超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL s)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中 CTX- M-型耐药基因的初步分布情况。方法 根据 Gen Bank的基本序列 (CTX- M- 1、CTX- M- 9和CTX- M- 8)而设计 3对引物 ,分别用这些引物对表型确认试验证实产 ESBL s的细菌进行 PCR扩增。结果 98株产 ESBL s细菌中 ,5 6株产 CTX- M-型 β-内酰胺酶 ,其中 CTX- M- 1、CTX- M- 9和 CTX- M- 8来源的分别为 30、2 9和 0株。结论 合肥市有产 CTX- M-型

西加毒素(CTX)的电子结构及构效关系研究

应用MNDO方法对CTX衍生物进行了量子化学计算 ,得到了它们的电子结构信息.根据构象分析研究了它们的空间结构.推测出它们的活性部位 ,探讨了与受体结合时的作用方式 ,讨论了结构 -活性关系 ,解释了活性差异的原因.研究结果表明该类化合物的D、E。

低剂量CTX、5-Fu对肝癌患者免疫状态的影响

将４３例肝癌患者随机分为两组分别应用低剂量ＣＴＸ、５－Ｆｕ进行治疗，并动态检测了治疗前后Ｔ淋巴细胞亚群、ＮＫ细胞、白细胞介素－２（ＩＬ－２）活性及Ｂ淋巴细胞转化试验的变化。结果：ＣＴＸ、５－Ｆｕ均可有效地抑制ＣＤ＋８Ｔ淋巴细胞，但ＣＴＸ可抑制Ｂ淋巴细胞转化；５－Ｆｕ不仅可提高ＮＫ细胞活性，且对ＩＬ－２及Ｂ淋巴细胞转化无影响。提示低剂量ＣＴＸ、５－Ｆｕ治疗可作为肝癌患者围手术期免疫调节治疗的有效方法。

姜黄素联合环磷酰胺对人淋巴瘤耐药细胞株HT/CTX的增殖抑制作用及其与FA/BRCA途径的关系

本研究探讨姜黄素联合环磷酰胺(CTX)对人淋巴瘤耐药细胞株HT/CTX100增殖抑制作用及其与FA/BRCA途径的关系,进一步探讨其作用机制。用MTT法检测细胞增殖抑制率;用Western blot检测FA/BRCA途径中的关键蛋白FANCD2;用流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡。结果表明:姜黄素可增强CTX对HT/CTX细胞的毒性,通过抑制FA/BRCA途径发挥作用,而姜黄素抑制FA/BRCA途径是通过抑制FANCD2单泛素化来实现的。姜黄素与CTX协同作用时,姜黄素介导的FA/BRCA途径受抑制,姜黄素对耐药细胞株HT/CTX诱导凋亡作用增强,而单药作用则无此效应,也不伴有FA/BRCA途径受抑制。结论:姜黄素通过抑制FA/BRCA途径中的FANCD2单泛素化而逆转细胞对化疗药物的耐药性,姜黄素与小剂量DNA交联剂类化疗药物合用是一种安全有效的逆转耐药治疗方案。

不携带霍乱毒素基因的CTXΦ类前噬菌体基因组克隆与分析

霍乱弧菌的霍乱毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码 ,由此携带毒素基因在产毒株与非产毒株间水平转移。从无ctxAB的ElTor型菌株中 ,发现不同时间、地点来源的部分菌株仍带有CTXΦ基因组的其它基因 ,在研究菌株染色体上呈双拷贝串联排列。克隆后测序发现基因组全长 5 70 8bp ,其抑制基因rstR却与古典型菌株来源CTXΦ的相同 ,因此从E1Tor菌株中发现整合有古典型来源的这类噬菌体。其它各基因与CTXΦ序列基本一致 ,但nct CTXΦ的zot基因末端及下游间隔区与CTXΦ的相差很大 ,进一步的序列测定与比较表明nct CTXΦ中无ctxAB应是其固有结构 ,而不是ctxAB丢失所形成的。将这种独特的前噬菌体命名为nct CTXclassΦ。研究菌株染色体上nct CTXΦ基因组上下游也各存在TLC因子和RTX毒力基因簇的同源序列 ,揭示它们与nct CTXΦ基因组有与CTXΦ相同的联系。从序列分析上认为nct CTXΦ与CTXΦ在遗传分化上有不同 ,可能是CTXΦ的前体形式 ,这对CTXΦ的来源。

眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB4细胞凋亡及其机制研究

目的探讨眼镜蛇毒细胞毒素CTX-d诱导NB细胞凋亡的机制。方法MTT法测定CTX-d体外细胞毒作用,电镜、流式细胞仪观察CTX-d对NB4细胞的诱导凋亡作用,流式细胞仪检测NB4细胞线粒体膜电位的变化,Western-blotting测定胞浆细胞色素C及caspase-9、caspase-3的变化。结果CTX-d作用NB4细胞6、12h的IC50分别为1.8、1.35μg/mL;CTX-d引起NB4细胞线粒体肿胀、核固缩等形态学改变;诱导NB4细胞出现亚G1期的凋亡峰,且有时效及量效关系;CTX-d(1.0μg/mL)作用0.5h,NB4细胞线粒体膜电位已开始下降,同时在胞浆中检测到细胞色素C,显示细胞色素C已由线粒体释放入胞浆;caspase-9酶原的量在CTX-d(1.0μg/mL)作用1h时开始下降,而活化的caspase-3片断在0.5h即检测到,表明除了通过caspase-9,CTX-d还可能通过其他途径激活caspase-3。结论CTX-d可通过降低线粒体膜电位、细胞色素C释放,激活caspase-9和caspase-3,从而诱导NB4细胞凋亡,还可能通过其他途径激活caspase-3,参与凋亡作用。

补肾活血中药干预对去卵巢膝骨关节炎大鼠E2及CTX-Ⅱ的影响

目的:研究补肾活血中药干预对去卵巢膝骨关节炎大鼠血清雌二醇(E2)、Ⅱ型胶原羧基端端肽(CTX-Ⅱ)水平的影响。方法:将30只健康雌性SD大鼠按体重均衡原则随机分为对照组、模型组、中药干预组,每组10只。模型组、中药干预组予以切除双侧卵巢、切断右膝交叉韧带,制造绝经后膝骨关节炎模型,中药干预组每天予以补肾活血中药组方的混悬液灌胃;对照组仅予以模拟切口处理。6周后,取大鼠右侧膝关节股骨髁部的软骨行病理检查,采集大鼠血清检测E2、CTX-Ⅱ的水平。结果:中药干预组股骨髁软骨Mankin评分低于模型组(t′=-7.0365,P<0.05);中药干预组血清E2水平高于模型组(t=2.8022,P<0.05);中药干预组血清CTX-Ⅱ水平明显低于模型组(t=5.9204.P<0.01)。结论:补肾活血中药干预可以引起血清雌激素水平的提高和血清CTX-Ⅱ水平的的降低,改善去卵巢膝骨关节炎大鼠软骨代谢,抑制软骨退变。

运用变性高效液相色谱快速检测CTX-M超广谱β内酰胺酶基因型

目的直用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对确认产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 CTX-M 型质粒酶进行基因分型,探讨其灵敏度和特异度,以建立快速检测 CTX-M 型 ESBLs 的新方法。方法采用 PCR 技术从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出 CTX-M 型质粒的编码序列,用 DHPLC 技术对扩增产物进行分析和 DNA 测序,确定其基因突变的类型,通过比对两者结果后确定其基因型。结果从34株产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出35份 CTX-M 型 ESBLs 编码序列(其中1株同时扩增到2份 CTX-M 型编码序列)。11份与标准菌株 CTX-M-3一致:4份与标准菌株 CTX-M-9一致;测序确定分别为 CTX-M-3型和 CTX-M-9型:20份表现为3种形态各异的异常洗脱峰,测序结果表明20份样本与其标准株对比均存在着基因突变,DHPLC 中异常峰一致的样本均为同一基因亚型。结论 DH-PLC 可用于 ESBLs 基因分型的检测,能快速检测 CTX-M 的基因型,具有准确性高、简便快捷、经济等特点,有很大的临床应用价值。

El Tor型CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的转染性研究

研究丝状噬菌体CTXΦ对O1群不同霍乱弧菌的水平转移效率及菌株的噬菌体免疫能力.利用带有氯霉素抗性基因遗传标记的CTXETΦ感染颗粒对O1群的4株不同霍乱弧菌进行体外和体内转染实验,根据氯霉素抗性筛选转染子,通过Southern Blot等方法进行验证并判断CTXΦ基因组的存在形式,计算比较不同菌株的转染率,分析转染及噬菌体免疫机制.带有遗传标记的CTXETΦ对古典型霍乱弧菌1119的体内转染率高于体外;体内转染实验中,古典菌株1119的转染率远高于其它3株El Tor型霍乱弧菌;在El Tor型霍乱弧菌中,不含rstR基因的IEM101的转染率高于另外两株带有rstR基因的霍乱弧菌2～3个数量级.古典型霍乱弧菌比El Tor型菌株对CTXETΦ噬菌体颗粒更易感,TCP菌毛的表达和rstR基因介导的噬菌体免疫影响CTXΦ在霍乱弧菌中的水平转移.

利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体

【目的】利用高效基因编辑系统(p HDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增p CBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切p HDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体。【结果】重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致。成功构建了巨桉CTX基因家族p HDE-CTXA、p HDE-CTXB和p HDE-CTXC同源表达载体。【结论】利用p HDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。

“3+X”高考模式透视——兼谈CTX高考模式

我国高考模式的变更是极其频繁的。之所以如此，既有深刻的社会背景和历史原因，也有教育内部的尖锐矛盾。对即将在全国实行的高考“３＋Ｘ”模式进行一些分析，就可见这种矛盾的尖锐。根据对这种矛盾的认识来探讨高考改革的基本思路，也许是有益的。一、“３＋Ｘ”模式的...

ISEcp1B介导铜绿假单胞菌CTX-M型ESBLs传播的分子机制研究

目的了解CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)在铜绿假单胞菌传播的分子机制。方法用K ir-by-Bauer(K-B)药敏法分析26株铜绿假单胞菌的耐药性;用多重聚合酶链式反应(PCR)扩增ESBLs、ISEcp1B插入序列及I类整合子;用套式PCR在Ⅰ类整合子寻找β-内酰胺酶基因盒。结果26株多重耐药铜绿假单胞菌对下列抗生素的耐药率为:(1)头孢噻肟(69.23%)、哌拉西林(65.38%)、替卡西林/克拉维酸(65.38%)、头孢他啶(57.69%)、头孢吡肟(46.15%)、环丙沙星(50.00%)、氨曲南(46.15%)、阿米卡星(34.62%)、亚胺培南(30.77%)、头孢哌酮/舒巴坦(23.08%);(2)11株铜绿假单胞菌中检出CTX-M-G1,其中4株同时检出TEM、SHV、CTX-M-G1、ISEcp1B及I类整合子,I类整合子内未扩增出β-内酰胺酶;(3)ISEcp1B下游均连接CTX-M型ESBLs,ISEcp1B右端有一个反向重复序列,为转位酶提供作用位点;-35及-10位点各有一个启动子,对下游不同的CTX-M型ESBLs的高水平表达和传播起重要的调控作用。结论ISEcp1B可能对下游CTX-M型ESBLs的高水平表达和传播起重要的调控作用。

CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶抗体的制备及鉴定

目的制备CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)抗体,为其后续研究提供实验材料。方法体外表达CTX-M-38型ESBLs;采用扩散洗脱法回收与纯化CTX-M-38型ESBLs蛋白;采用传统动物免疫技术制备酶蛋白抗体;分别采用间接酶联免疫吸附试验、辛酸沉淀法及Western blot印迹杂交技术,完成抗体滴度检测、抗体纯化及特异性鉴定。结果 SDS-PAGE中约30 kD处出现明显蛋白条带;所制备酶蛋白抗体滴度为1∶16 000;Western blot印迹杂交显示不同稀释度的抗体均与同一蛋白条带(约30 kD)反应,此条带与CTX-M-38型EBSLs蛋白大小相一致。结论制备酶蛋白抗体滴度及特异性较好,可用于后续研究。