Molecular Replacement Studies of Cucurmosin from Cucurbita Moschata:Structure Homology with Trichosanthin

High diffraction quality crystals of cucurmosin, a type I ribosome inactivating protein isolated from the sarcocarp of Cucurbita moschata (pumpkin), have been grown under newly optimised conditions. With in-house rotating anode X-ray source, these crystals diffract to 1.65 ?resolution which is much higher than that of the previously reported crystals that diffracted only to 3 ?resolution. The crystals belong to space group P212121 with cell parameters a = 41.5, b = 58.4 and c = 99.3 . Molecular replacement studies indicate that the cucurmosin structure is homologous to trichosanthin. The initial structural model has been obtained and the model fitting/ refinement is in progress.

免疫毒素Trastuzumab-Cucurmosin(T-CUS)的制备及鉴定

目的制备由抗人类表皮生长因子受体2(HER-2/NEU)单克隆抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab,简称T)与南瓜蛋白(Cucurmosin,简称CUS)偶联而成的免疫毒素,并进行鉴定。方法以N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)为偶联剂,制备T-CUS,经过Ni Sepharose 6 Fast Flow和SP Sepharose 6 Fast Flow纯化后SDS-PAGE分析其纯度及成分,细胞ELISA法检测其对人乳腺癌BT-474细胞的结合能力。结果 SDSPAGE分析显示T-CUS免疫毒素成功构建,免疫毒素基本保留了对BT-474细胞的结合能力。结论利用SPDP可实现曲妥珠单抗与CUS的成功偶联。

南瓜蛋白对B16细胞的诱导分化作用

目的测定南瓜蛋白对小鼠黑色素瘤B16细胞的诱导分化作用。方法以MTT法测定南瓜蛋白对B16细胞的增殖抑制作用,并以形态学、黑色素含量及细胞周期变化为指标,观察南瓜蛋白诱导B16细胞分化的作用。结果南瓜蛋白对B16细胞具有明显的增殖抑制作用,并阻止B16细胞由G1期向S期过渡从而停滞于G1期;细胞形态向正常上皮样细胞分化,生长缓慢,平铺不重叠,甚至形成网状结构,胞质内细胞器丰富,黑色素小体明显增多;黑色素含量增加。结论南瓜蛋白对B16细胞具有明显的诱导分化作用。

南瓜蛋白联合吉非替尼对人胰腺癌BxPC-3细胞的抑制作用

目的研究南瓜蛋白(cucurmosin,CUS)联合表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Gefitinib,GEF)对人胰腺癌细胞株Bx-PC-3的生长抑制作用。方法采用SRB法测定CUS与GEF联用对体外培养的BxPC-3细胞的增殖抑制作用;应用集落形成实验测定CUS与GEF联用对体外培养的BxPC-3细胞集落形成的影响;以Western blot技术检测CUS与GEF联用对体外培养的BxPC-3细胞EGFR的影响。结果 CUS联用GEF对BxPC-3细胞的增殖抑制率大于单用药物,q>0.85;CUS联用GEF对BxPC-3细胞的集落形成抑制率大于单用药物,q>1.15;CUS联合GEF干预BxPC-3细胞可明显下调其EGFR蛋白表达,q>2.0。结论 CUS联合GEF对人胰腺癌BxPC-3细胞的生长抑制具有协同作用。

南瓜蛋白对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的观察南瓜蛋白对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法采用MTT法观察南瓜蛋白对PANC-1细胞生长抑制情况;非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠(NOD/SCID)小鼠体内观察南瓜蛋白对胰腺原位移植瘤的抑瘤率;电镜观察南瓜蛋白作用后PANC-1细胞超微结构的改变;流式细胞仪定量检测其细胞周期和凋亡发生率的影响;ELISA法定量检测南瓜蛋白作用后PANC-1细胞Caspase-3活性变化。结果 0.125、0.25、0.5mg/kg的南瓜蛋白对小鼠移植瘤抑瘤率(%)分别为45.2、50.0、59.7(P<0.05)。南瓜蛋白10μg/mL作用PANC-1细胞24h,部分细胞开始凋亡,表现为核内染色质浓集,出现核碎裂,作用72h,凋亡细胞增多,表现为染色质聚集,部分核膜消失,凋亡小体出现;南瓜蛋白(0、2.5、10、40μg/mL)作用PANC-1细胞72h,流式细胞周期分析显示G0/G1期的比例(%)分别为46.56±5.08、53.33±5.05、67.50±6.50和77.00±6.73(P<0.05),annexin V/PI分析显示PANC-1细胞凋亡率(%)分别为2.50±0.13、8.30±1.23、23.40±2.45和48.50±3.65(P<0.05);Caspase-3活性分别为0.009±0.002、0.011±0.003、0.035±0.009和0.065±0.009酶活力单位(P<0.05),提示南瓜蛋白以浓度依赖性诱导PANC-1细胞凋亡;40μg/mL南瓜蛋白作用PANC-1细胞24、48、72h,G0/G1期的比例(%)分别为56.60±6.65、67.83±6.76和77.00±6.73(P<0.05),annexin V/PI分析显示PANC-1细胞凋亡率(%)分别为16.51±2.97、38.51±2.38和48.50±3.65(P<0.05),提示南瓜蛋白以时间依赖性诱导PANC-1细胞凋亡。结论南瓜蛋白对PANC-1细胞具有明显的抑制作用,诱导G0/G1周期阻滞和细胞凋亡可能是其主要机制。

南瓜蛋白抗人慢性髓系白血病细胞系K562的作用研究

本研究观察南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)在人慢性髓系白血病(CML)K562细胞-NOD/SCID小鼠的皮下移植瘤和白血病模型体内抗肿瘤活性。采用建立K562-NOD/SCID小鼠皮下移植瘤和白血病模型,分别使用二种模型评价CUS在小鼠体内的抗K562活性。结果表明,给药剂量为0.5 mg/kg和1 mg/kg的CUS对人CML皮下移植瘤的抑瘤率分别为53.45%和59.43%;而剂量为0.25 mg/kg和0.5 mg/kg的CUS给药组小鼠的生存时间分别为39.8±5.5 d和43.4±6.6 d,抑瘤率分别为24.9%和36%。结论:CUS对小鼠体内人CML细胞系K562具有显著的抑制作用。

南瓜蛋白联合常用化疗药对NB4细胞增殖和凋亡的影响

本研究旨在探讨南瓜蛋白(CUS)与全反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(ATO)联用对人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响。以MTT比色法检测CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞的增殖抑制作用,用流式细胞术检测CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞凋亡的影响,用金氏公式判断两药联用的协同效果。结果表明,CUS与ATRA或ATO联合应用的抑制率均大于各药相应浓度单用的抑制率,其协同指数q值均>0.85,并且两药均在低浓度范围内联用的协同效果明显。CUS与ATRA或ATO联合应用时NB4细胞的凋亡率均大于各药相应浓度单用时的凋亡率,其协同指数q值均>1.15。结论:CUS与ATRA或ATO联用对NB4细胞增殖和诱导凋亡均有较好的协同作用。

南瓜蛋白对人胰腺癌细胞系PANC-1的细胞毒性及化疗增敏作用

目的观察南瓜蛋白(CUS)对人胰腺癌细胞系PANC-1的细胞毒性和化疗增敏作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,观察不同浓度(量效)的CUS及作用不同时间(时效)对胰腺癌细胞PANC-1的细胞毒性;采用Chou Talalay联合指数法判断CUS增加胰腺癌细胞对吉西他滨(GEM)的化疗敏感性。结果CUS对胰腺癌PANC-1细胞具有显著的增殖抑制作用,0.3125,0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0μg/mL的CUS作用于胰腺癌细胞24 h,其抑制率分别为9.16%,11.9%,14.4%,20.2%,32.0%,36.4%,44.1%,50.3%和58.6%,呈现明显的剂量依赖性;随着作用时间的延长,其抑制率明显增加,24,48,72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为40.24,8.24,1.17μg/mL,呈现明显的时间依赖性。两药在不同效应时各自所需浓度之间相互作用均为协同作用(CI<1),单吉西他滨用于胰腺癌细胞的IC50为36.76 nmol/L,CUS与其合用时的IC50为12.14 nmol/L,合用比单用时吉西他滨的剂量减少67.0%。结论CUS对胰腺癌的细胞毒性作用呈明显的剂量依赖性和时间依赖性,与吉西他滨联合使用可增加其细胞毒作用,起到化疗增敏效应。

南瓜蛋白诱导人胰腺癌细胞凋亡的线粒体机制

目的 探讨南瓜蛋白（CUS）诱导人胰腺癌细胞（PANC）-1凋亡的线粒体机制.方法 0、2.5、10.0、40.0 mg/L的CUS处理胰腺癌PANC-1 72 h,荧光显微镜和流式细胞仪观察线粒体膜电位（△Ψm）的变化,Western blot检测胞质细胞色素C（Cyt-C）的含量变化和细胞半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-9（Caspase-9）和Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（bax）蛋白的表达水平.结果 0、2.5、10.0、40.0 mg/L CUS处理PANC-1 72 h后,△Ψm逐渐下降,分别为167.23±8.27、123.56±7.26、83.25±5.36和40.45±5.87,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blot结果显示线粒体Cyt-C释放到细胞质的量逐渐增加,灰度值分别为0.29±0.05、1.69±0.35、1.87±0.40、2.47±0.32（P＜0.05）;Caspase-9、Caspase-3和bax蛋白的表达逐渐增强,且其作用呈剂量依赖性（Caspase-9灰度值分别为0.15±0.03、0.19±0.05、0.49±0.09、0.89±0.08,P＜0.05;Caspase-3灰度值分别为0.88±0.08、1.81±0.19、2.36±0.38、2.92±0.24,P ＜0.05;bax灰度值分别为0.79±0.18、1.66±0.31、2.61±0.41、3.67±0.24,P＜0.05）;而bcl-2蛋白表达无明显变化（bcl-2灰度值分别为0.88±0.08、0.82±0.18、0.84±0.04、0.82±0.13,P＞0.05）.结论 线粒体途径在CUS诱导胰腺癌细胞凋亡中起重要作用,其机制可能是CUS通过激活促凋亡蛋白bax表达增加,降低△Ψm,促进线粒体Cyt-C的释放,从而激活Caspase系列酶,诱导胰腺癌细胞凋亡.

南瓜蛋白对人胰腺癌细胞CFPAC-1增殖抑制及诱导凋亡作用

目的探讨南瓜蛋白(CUS)体外对人胰腺癌细胞CFPAC-1的增殖抑制及诱导凋亡作用。方法甲基噻唑基四唑法检测南瓜蛋白对CFPAC-1细胞的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞凋亡的形态学变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,蛋白质印迹法检测caspase-3及bcl-2蛋白表达水平。结果不同浓度(0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1及2μmol.L-1)南瓜蛋白作用不同时间(24、48及72 h)后,南瓜蛋白对胰腺癌细胞有增殖抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。1μmol.L-1南瓜蛋白作用72 h后,电镜下可见明显凋亡改变,并可见凋亡小体。流式细胞仪结果示,与对照组相比,S期细胞减少,G0/G1期细胞增多,细胞由G0/G1期进入S期延缓;不同浓度(0、0.062 5、0.25及1μmol.L-1)南瓜蛋白作用72 h后细胞凋亡率分别为(0.33±0.37)%、(19.26±1.49)%、(37.13±2.07)%及(55.64±2.91)%。随着药物浓度的增高,caspase-3蛋白表达逐渐增强,bcl-2蛋白表达逐渐减弱。结论南瓜蛋白对人胰腺癌细胞CFPAC-1具有明显抑制作用;南瓜蛋白可能通过上调caspase-3及下调bcl-2蛋白表达诱导胰腺癌细胞凋亡。

南瓜蛋白对人胰腺癌SW1990细胞株的诱导凋亡作用

目的探讨南瓜蛋白体外对人胰腺癌SW1990细胞株的诱导凋亡作用。方法 MTT法检测南瓜蛋白对SW1990细胞的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞凋亡表现,流式细胞仪检测其凋亡率,Western blot法检测caspase-3蛋白的表达。结果不同浓度(1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00及80.00μg/ml)南瓜蛋白作用不同时间(24、48及72 h)后,南瓜蛋白对胰腺癌细胞具有生长抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。40.00μg/ml南瓜蛋白作用72 h后,透射电镜下可见细胞出现明显的凋亡改变,并可见凋亡小体;不同浓度(0、2.50、10.00、40.00μg/ml)南瓜蛋白作用72 h后,细胞的凋亡率分别为(0.30±0.11)%、(18.93±1.06)%、(28.00±2.07)%及(49.93±3.25)%,随着药物浓度的升高,细胞的凋亡率逐渐增加,呈浓度依赖性(P<0.05);caspase-3蛋白表达随着药物浓度的升高逐渐增强,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论南瓜蛋白可能通过上调caspase-3蛋白的表达诱导胰腺癌细胞凋亡。

南瓜蛋白联合常用化疗药物对人胰腺癌BxPC-3细胞的体外抑制作用

目的研究南瓜蛋白（CUS）联合胰腺癌常用化疗药物吉西他滨（GEM）、氟尿嘧啶（5-FU）、紫杉醇（erx）、顺铂（DDP）对人胰腺癌细胞株BxPC-3的增殖抑制作用。方法采用磺酰罗丹明B（SRB）比色法测定CUS分别与GEM、5-FU、PTX、DDP联用对体外培养的BxPC-3细胞的增殖抑制作用；应用集落形成实验测定CUS分别与GEM、5-FU、PTX、DDP联用对体外培养的BxPC-3细胞集落形成的影响；用金氏公式判断药物联用的协同效果。结果CUS联用GEM、5-FU、HIX、DDP对BxPC．3细胞的增殖抑制率均大于各药单用的抑制率，q〉0．85；CUS与胰腺癌常用化疗药物均在低浓度范围内联用的相加效果明显。CUS联用GEM、5-FU、PTX、DDP对BxPC-3细胞的集落形成抑制率均大于各药单用的抑制率，q〉1．15。结论CUS联合GEM、5-FU、PTX、DDP常用化疗药物对体外培养的BxPC-3细胞的生长抑制具有较好的协同作用。