CUL5基因沉默对连续照射期间CNE2细胞增殖状况影响的研究

背景与目的:本课题组前期已应用不同的实验方法对鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)在连续分割照射中的细胞增殖状态进行了研究,明确了CNE2细胞株在连续分割照射中存在中后期加速再增殖现象,同时应用基因芯片技术、实时荧光定量PCR筛选出与照射后CNE2细胞株增殖状态相关的差异基因。CUL5基因为细胞增殖活性增高时的上调基因之一,其在照射增殖活性最高时相与最低时相表达差异在2倍以上,因此本研究选择CUL5作为开展功能研究的目的基因,应用RNA干扰技术沉默CUL5基因,观察人鼻咽癌细胞株CNE2在连续照射中后期加速增殖现象是否受到影响。方法:构建、培养出CUL5基因沉默效果稳定的人鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5,接受射线2Gy/d,每天1次,连续照射5d,每天分别用四唑盐比色法(MTT法)检测细胞相对增殖率、流式细胞术检测照射后细胞周期分布情况。结果:MTT法检测出照射第1～5天细胞相对增殖率,实验组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5)分别为1.03±0.05、0.97±0.03、0.84±0.12、0.54±0.09、0.33±0.11,阴性对照组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC)分别为1.07±0.09、0.96±0.12、1.21±0.04、1.19±0.04、0.91±0.02;空白对照组(CNE2)分别为1.07±0.09、0.97±0.05、1.22±0.07、1.22±0.04、0.97±0.04,实验组与阴性及空白对照组均有显著差异(P<0.001)。流式细胞术检测出实验组在连续照射第1天增殖速度最快,增殖最旺盛,后逐渐下降,第5天增殖最慢,增殖活性最低;对照组第3天增殖速度最快,第5天增殖最慢。结论:CUL5基因沉默的CNE2细胞连续分割照射期间加速增殖现象有所改变。

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法:根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论:CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。

稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系建立

目的:建立稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系,探讨CUL5在连续分割照射下鼻咽癌细胞加速再增殖现象中所起的作用。方法:设计并合成能表达针对CUL5基因的shRNA的DNA序列,构建真核表达载体;脂质体转染重组质粒至人鼻咽癌细胞株CNE2;G418筛选阳性细胞并扩大培养;RT-PCR检测连续分割照射前后阳性细胞CUL5基因沉默效果。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列;G418筛选所得阳性细胞经RT-PCR证实照射前后均能抑制CUL5基因表达。结论:成功建立CUL5基因沉默的CNE2细胞系。

干扰Cul5对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究泛素连接酶库伦-5(Cullin5,Cul5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,本实验采用牛肌卫星细胞进行体外实验模拟牛体内的成肌分化过程,根据基因的表达序列设计Cul5的小干扰RNA(si-RNA),通过实时定量PCR(qRT-PCR)蛋白质印迹(Western Blot)技术筛选出干扰效果最好的si-RNA转染细胞。成功干扰Cul5后,在转录、蛋白、细胞水平上分别采用qRT-PCR、Western Blot和EdU细胞增殖实验,检测细胞增殖及分化标志因子的表达水平。试验发现,干扰Cul5后,在蛋白水平上Pax7呈显著上调趋势,MyHC呈显著下调趋势,EdU染色阳性细胞率与对照组相比呈显著上调趋势。细胞光镜图下,实验组肌管的数量明显少于对照组。研究结果可见:敲低Cul5的表达能够促进牛肌卫星细胞的增殖,并抑制其分化进程。

CUL53’-UTR双荧光素酶报告载体构建及与MiR-148a-3p靶向验证

目的 :构建CUL5基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-148a-3p与CUL5的靶向关系。方法 :利用生物信息学软件预测miR-148a-3p与CUL5结合位点;利用PCR扩增CUL5基因3'-UTR序列,将其克隆到pmiR-RB-Report TM双荧光素酶报告基因载体中,同时构建CUL5 3’UTR突变载体;将miR-148a-3p及阴性对照分别与野生型has-CUL5-wt 3'-UTR及突变型has-CUL5-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果 :Targetscan、PicTar、miRanda、PITA、miRDB数据库预测结果显示,miR-148a-3p与CUL5基因3’UTR存在互补结合位点。酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性实验表明,miR-148a-3p mimics能够与CUL5基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性;对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光活性有所上升。结论 :miR-148a-3p能够与CUL5靶向性结合,CUL5是miR-148a-3p新的靶基因。

Cul5基因抑制卵巢癌细胞生长

目的观察cullin5（cul5）基因对OVCAR3细胞生长活性和增殖的影响。方法构建cul5的过表达和敲降质粒。用Western印迹检测质粒的有效性。用MTF和集落形成实验检测cul5对OVCAR3细胞增殖的影响。结果酶切和测序鉴定表明质粒构建成功。实验表明，过表达cul5能够抑制OVCAR3细胞的生长活性和集落形成率，敲降cul5能够增强OVCAR3细胞的生长活性和集落形成率。结论cul5在卵巢癌中起到抑癌基因的作用。