CUL4相关因子7、微RNA-589-5p在结直肠癌组织中表达与临床病理特征及预后的关系

目的 分析结直肠癌组织中CUL4相关因子7(DCAF7)、微RNA-589-5p(miR-589-5p)表达水平,并探讨其与结直肠癌临床病理特征及预后的关系。方法 纳入2018年9月至2019年9月于宝鸡市人民医院行结直肠癌根治术的78例。采用实时荧光定量PCR法检测组织中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表达水平。免疫组化法检测组织中DCAF7表达。Spearman法分析组织miR-589-5p与DCAF7的相关性。分析miR-589-5p、DCAF7水平与结直肠癌临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法分析结直肠癌组织miR-589-5p、DCAF7表达与病人预后的关系,多因素Cox回归分析影响结直肠癌预后的因素。结果 Ualcan数据库中,结肠腺癌组织中miR-589表达水平低于癌旁组织(P<0.05),DCAF7表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。与癌旁组织相比,结直肠癌组织中DCAF7阳性表达率及DCAF7 mRNA相对表达水平(2.79±0.84比1.02±0.31)较高(P<0.05),miR-589-5p相对表达水平(0.44±0.09比1.04±0.22)较低(P<0.05)。Spearman相关分析显示,组织中miR-589-5p与DCAF7表达水平呈负相关(P<0.05)。miR-589-5p、DCAF7均与淋巴结转移、肿瘤浸润深度相关(P<0.05)。Kaplan-Meier法显示,miR-589-5p高表达组病人平均生存时间显著长于miR-589-5p低表达结直肠癌病人(P<0.05),DCAF7阴性表达病人平均生存时间显著长于DCAF7阳性表达病人(P<0.05)。多因素分析表明,淋巴结有转移、miR-589-5p低表达、DCAF7阳性是影响结直肠癌病人不良预后的独立危险因素(P<0.05)。与Control组比,miR mimic组miR-589-5p表达(2.58±0.32比1.02±0.12)显著升高(P<0.05),DCAF7表达(0.37±0.06比1.01±0.12)、侵袭细胞数(60.88±9.94比178.52±26.08)个显著降低(P<0.05);与miR mimic组比,miR mimic+pc-DCAF7组DCAF7表达、侵袭细胞数显著升高(P<0.05)。结论 结直肠癌组织中DCAF7呈高表达、miR-589-5p呈低表达,与结直肠癌淋巴结转移、肿瘤浸润深度以及不良预后有关。

CUL5基因沉默对连续照射期间CNE2细胞增殖状况影响的研究

背景与目的:本课题组前期已应用不同的实验方法对鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)在连续分割照射中的细胞增殖状态进行了研究,明确了CNE2细胞株在连续分割照射中存在中后期加速再增殖现象,同时应用基因芯片技术、实时荧光定量PCR筛选出与照射后CNE2细胞株增殖状态相关的差异基因。CUL5基因为细胞增殖活性增高时的上调基因之一,其在照射增殖活性最高时相与最低时相表达差异在2倍以上,因此本研究选择CUL5作为开展功能研究的目的基因,应用RNA干扰技术沉默CUL5基因,观察人鼻咽癌细胞株CNE2在连续照射中后期加速增殖现象是否受到影响。方法:构建、培养出CUL5基因沉默效果稳定的人鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5,接受射线2Gy/d,每天1次,连续照射5d,每天分别用四唑盐比色法(MTT法)检测细胞相对增殖率、流式细胞术检测照射后细胞周期分布情况。结果:MTT法检测出照射第1～5天细胞相对增殖率,实验组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5)分别为1.03±0.05、0.97±0.03、0.84±0.12、0.54±0.09、0.33±0.11,阴性对照组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC)分别为1.07±0.09、0.96±0.12、1.21±0.04、1.19±0.04、0.91±0.02;空白对照组(CNE2)分别为1.07±0.09、0.97±0.05、1.22±0.07、1.22±0.04、0.97±0.04,实验组与阴性及空白对照组均有显著差异(P<0.001)。流式细胞术检测出实验组在连续照射第1天增殖速度最快,增殖最旺盛,后逐渐下降,第5天增殖最慢,增殖活性最低;对照组第3天增殖速度最快,第5天增殖最慢。结论:CUL5基因沉默的CNE2细胞连续分割照射期间加速增殖现象有所改变。

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法:根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论:CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。

稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系建立

目的:建立稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系,探讨CUL5在连续分割照射下鼻咽癌细胞加速再增殖现象中所起的作用。方法:设计并合成能表达针对CUL5基因的shRNA的DNA序列,构建真核表达载体;脂质体转染重组质粒至人鼻咽癌细胞株CNE2;G418筛选阳性细胞并扩大培养;RT-PCR检测连续分割照射前后阳性细胞CUL5基因沉默效果。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列;G418筛选所得阳性细胞经RT-PCR证实照射前后均能抑制CUL5基因表达。结论:成功建立CUL5基因沉默的CNE2细胞系。

结直肠癌组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白的表达变化及其意义

目的观察结直肠癌(CRC)组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DNA损伤结合蛋白1和CUL4相关因子7(DCAF7)蛋白的表达变化,并探讨其临床意义。方法CRC患者98例,均接受手术治疗,术中留取CRC组织和癌旁组织,采用Real-time PCR法检测CRC组织和癌旁组织中miR-138-5p、miR-876-5p,采用蛋白印迹法检测CRC组织和癌旁组织中DCAF7蛋白,分析miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者临床病理参数的关系。以CRC组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量的中位数为临界值,将CRC患者分为miR-138-5p高表达组和miR-138-5p低表达组、miR-876-5p高表达组和miR-876-5p低表达组、DCAF7蛋白高表达组和DCAF7蛋白低表达组,并分析miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者预后的关系。结果CRC组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量分别为1.36±0.29、1.41±0.36、0.59±0.19,癌旁组织中miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量分别为2.15±0.48、2.08±0.44、0.20±0.08,两者相比,P均<0.05。miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者是否合并淋巴结转移、TNM分期、浸润深度有关(P均<0.05)。miR-138-5p低表达组3年总体生存率为67.3%,miR-138-5p高表达组3年总体生存率为86.6%,两组相比,P<0.05。miR-876-5p低表达组3年总体生存率为66.7%,miR-876-5p高表达组3年总体生存率为85.1%,两组相比,P<0.05。DCAF7蛋白高表达组3年总体生存率为67.2%,DCAF7蛋白低表达组3年总体生存率为87.5%,两组相比,P<0.05。结论CRC组织中miR-138-5p低表达、miR-876-5p低表达、DCAF7蛋白高表达,miR-138-5p、miR-876-5p、DCAF7蛋白相对表达量与CRC患者是否合并淋巴结转移、TNM分期、浸润深度有关。与miR-138-5p高表达、miR-876-5p高表达、DCAF7蛋白低表达的CRC患者相比,miR-138-5p低表达、miR-876-5p低表达、DCAF7蛋白高表达的CRC患者术后3年总体生存率低。

干扰Cul5对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究泛素连接酶库伦-5(Cullin5,Cul5)对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,本实验采用牛肌卫星细胞进行体外实验模拟牛体内的成肌分化过程,根据基因的表达序列设计Cul5的小干扰RNA(si-RNA),通过实时定量PCR(qRT-PCR)蛋白质印迹(Western Blot)技术筛选出干扰效果最好的si-RNA转染细胞。成功干扰Cul5后,在转录、蛋白、细胞水平上分别采用qRT-PCR、Western Blot和EdU细胞增殖实验,检测细胞增殖及分化标志因子的表达水平。试验发现,干扰Cul5后,在蛋白水平上Pax7呈显著上调趋势,MyHC呈显著下调趋势,EdU染色阳性细胞率与对照组相比呈显著上调趋势。细胞光镜图下,实验组肌管的数量明显少于对照组。研究结果可见:敲低Cul5的表达能够促进牛肌卫星细胞的增殖,并抑制其分化进程。

CUL53’-UTR双荧光素酶报告载体构建及与MiR-148a-3p靶向验证

目的 :构建CUL5基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,并验证miR-148a-3p与CUL5的靶向关系。方法 :利用生物信息学软件预测miR-148a-3p与CUL5结合位点;利用PCR扩增CUL5基因3'-UTR序列,将其克隆到pmiR-RB-Report TM双荧光素酶报告基因载体中,同时构建CUL5 3’UTR突变载体;将miR-148a-3p及阴性对照分别与野生型has-CUL5-wt 3'-UTR及突变型has-CUL5-mut 3'-UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果 :Targetscan、PicTar、miRanda、PITA、miRDB数据库预测结果显示,miR-148a-3p与CUL5基因3’UTR存在互补结合位点。酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性实验表明,miR-148a-3p mimics能够与CUL5基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性;对其预测靶位点进行突变后,突变型载体中的报告荧光活性有所上升。结论 :miR-148a-3p能够与CUL5靶向性结合,CUL5是miR-148a-3p新的靶基因。

Cul5基因抑制卵巢癌细胞生长

目的观察cullin5（cul5）基因对OVCAR3细胞生长活性和增殖的影响。方法构建cul5的过表达和敲降质粒。用Western印迹检测质粒的有效性。用MTF和集落形成实验检测cul5对OVCAR3细胞增殖的影响。结果酶切和测序鉴定表明质粒构建成功。实验表明，过表达cul5能够抑制OVCAR3细胞的生长活性和集落形成率，敲降cul5能够增强OVCAR3细胞的生长活性和集落形成率。结论cul5在卵巢癌中起到抑癌基因的作用。

一例3M综合征合并Netherton综合征家系的遗传学研究

目的 探讨一例3M综合征合并Netherton综合征胎儿的基因诊断及索源过程。方法 胎儿27周行脐静脉穿刺术,脐血及其父母血液提取gDNA,进行家系全外显子组测序,对发现的基因变异位点进行Sanger测序验证。结果 超声影像检查提示胎儿特殊面容、生长发育迟缓。胎儿CUL7基因存在复合杂合致病变异,变异1:c.3291_3294delTCAC(p.His1098Cysfs*42)杂合变异,父亲野生型,母亲杂合型;变异2:c.4717C>T(p.Arg1573*)杂合变异,父亲杂合型,母亲野生型,符合3M综合征Ⅰ型基因型。胎儿SPINK5基因存在复合杂合变异,变异1:c.2474_2475delAG(p.Glu825Glyfs*2)杂合致病变异,父亲杂合型,母亲野生型;变异2:c.2870delT(p.Leu957Gln*46)杂合变异,可能致病,父亲野生型,母亲杂合型,符合Netherton综合征基因型。结论 胎儿为3M综合征合并Netherton综合征,CUL7基因c.3291_3294delTCAC与SPINK5基因c.2870delT两个变异为首次报道。对超声影像筛查提示胎儿结构畸形推荐进行家系外显子组测序以早期明确诊断,实现优生优育。

Fe_(73.5)Cu_1Nb_3Si_(13.5)B_9软磁粉/硅橡胶力敏复合材料的逾渗特性

以三元嵌段共聚硅橡胶为基体,Fe73.5Cu1Nb3Si13.5B9软磁粉为应力敏感填充粒子,采用机械共混和精密铸压热成型方法制备出系列粉体含量的Fe73.5Cu1Nb3Si13.5B9软磁粉/硅橡胶接触应力敏感复合材料,重点研究了其交流阻抗、直流电阻、粒子间及粒子与硅橡胶间相互作用程度等性能的逾渗特性。研究表明,该柔性力敏复合材料具有较显著的交流阻抗双逾渗特性。分析发现,"第一逾渗区"内材料的交流阻抗值由粒子的隧道跃迁主导,"第二逾渗区"内材料的交流阻抗大小取决于Fe73.5Cu1Nb3Si13.5B9粒子链间的接触电阻值。