重组EV71和CVA16型手足口病双价VLP疫苗构建及免疫保护效果评价

目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达EV71和CVA16的病毒样颗粒，并对纯化的重组EV71、CVA16双价病毒样颗粒疫苗进行免疫效果评价。方法构建重组杆状病毒Bacmid-P1-3CD，转染Sf9昆虫细胞，纯化EV71、CVA16的病毒样颗粒并检测其形态和生物特性；通过EV71、CVA16的病毒样颗粒免疫ICR雌鼠后，以EV71、CVA16强毒株腹腔攻击5日龄乳鼠，对重组EV71、CVA16型双价VLP免疫保护性进行评价。结果利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建并表达EV71和CVA16病毒样颗粒，颗粒大小约为23-30nm，存在Mr约39000VP1特异性蛋白表达。重组EV71、CVA16双价VLP疫苗免疫接种能够诱导小鼠机体产生高效价的特异性抗体（EV71中和抗体效价为1：960，CVA16中和抗体效价为1：624）并发挥优于单价VLP疫苗的有效免疫保护效果。结论重组EV71、CVA16型双价VLP疫苗免疫原性和保护性显著高于单价疫苗，为手足口病疫苗的研发提供了新的思路及实验基础。。

2016年盐城市手足口病病原学特征及EV71和CVA16型肠道病毒VP1基因特征

目的了解2016年盐城市手足口病肠道病毒病原谱分布特征,并对鉴定为EV71、CVA16型肠道病毒VP1基因进行分子进化特征分析。方法收集疑似手足口病咽肛拭子标本,采用实时荧光RT-PCR方法检测通用、EV71和CVA16型肠道病毒核酸,以RT-PCR法扩增其VP1基因全长编码区并进行序列分析,采用MegAlign、mafft、MEGA等软件进行核苷酸及氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析。结果 2016年盐城市共收集疑似手足口病标本504份,检出肠道病毒核酸阳性165份,阳性率32.74%,EV71型、CVA16型、其他型别分别占4.37%、6.94%、21.43%。对EV71、CVA16型肠道病毒遗传进化树分析显示,盐城地区EV71和CVA16代表株分别属于C4a、B1b基因亚群进化分支,未发生基因亚群的转换,在各自进化分支中形成3条传播主链,远离各自原型株。结论 2016年盐城市手足病病原谱为多种基因型的肠道病毒共同流行。其他肠道病毒为优势病原体,EV71和CVA16仍占有一定比例。

婴幼儿人群中CVA16中和抗体与CVA16手足口病的相关性研究

目的分析婴幼儿中柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)中和抗体对CVA16手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的预防作用。方法随访2012年1月—2014年1月期间江苏省180名婴幼儿人群(6~<36月龄),主动监测CVA16-HFMD,分别采集0 d、2个月、8个月和24个月的系列血样,并检测其CVA16中和抗体。结果该人群在随访93.9~141 d期间发生了1起CVA16流行,共报告10例CVA16引起的HFMD。中和抗体结果显示,在CVA16流行前(2个月)CVA16中和抗体阴性的153例中,共有10例确诊为CVA16-HFMD(6.5%),49例在流行后(8个月)出现中和抗体阳转(阳转率为32.0%)。而在流行前CVA16中和抗体阳性的27例中,无1例患CVA16-HFMD,8例流行后呈中和抗体4倍及以上升高,占31.7%。10例CVA16-HFMD患者在流行后中和抗体均出现明显升高,较流行前平均升高51.71倍。结论婴幼儿人群中的CVA16中和抗体,可预防CVA16感染导致的HFMD。

一株CVA16病毒的基因型鉴定

目的:通过构建进化树对一株CVA16病毒进行基因分型。方法:将临床样本接种到Vero细胞上进行分离、扩增,提取基因组,对VP1基因进行测序及进化树分析。结果:接种CVA16的Vero细胞发生病变,成功分离该病毒株,根据VP1序列构建进化树,进化树显示该毒株为CVA16 B1b型毒株。结论:本鉴定结果为CVA16病毒的进一步研究和疫苗研制奠定了基础。

广西健康幼托儿童EV71和CVA16血清抗体水平分析

目的了解广西百色、都安、平果地区健康幼托儿童肠道病毒隐性感染状况,为手足口病防控提供科学依据。方法采集幼托机构健康儿童135例静脉血标本,酶联免疫(ELISA)法检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)IgM和IgG抗体,对检测结果进行分析。结果 135例健康幼托儿童血样中EV71 IgM抗体阳性3例(2.22%),CVA16 IgM抗体阳性12例(8.89%),EV71 IgG抗体阳性110例(81.48%),CVA16 IgG抗体阳性112例(82.96%)。女童EV71 IgM、IgG阳性率分别为0.00%,86.76%,男童的EV71 IgM、IgG阳性率分别为4.48%,76.12%;女童CVA16 IgM、IgG阳性率分别为0.00%,86.76%,男童的CVA16 IgM、IgG阳性率分别为4.48%,76.12%,性别差异无统计学意义(P>0.05)。结论肠道病毒EV71和CVA16的隐性感染在健康幼托儿童中较为普遍,学龄前儿童是感染高风险人群。

2014年湖南省郴州市手足口病病原谱及CVA16基因特征分析

目的了解2014年湖南省郴州市手足口病病原谱和优势毒株的基因特征,为郴州市手足口病的防治提供科学依据。方法采集2014年郴州市手足口病监测病例标本,应用荧光PCR方法检测HEV71、CVA16、CVA6、CVA10和其他肠道病毒。未能分型的其他HEV阳性标本进行RT-PCR扩增,通过基因测序鉴定病原体型别。结果共检测854份标本,阳性检出率为55.62%。病原谱中已知型别的前5位分别为CVA16(28.00%)、HEV71(25.05%)、CVA6(13.89%)、CVA10(12.42%)、CVB5(0.84%),仍有20.63%的其他HEV未分型。不同月份、不同年龄组、不同病例类型的病原体型别的构成比差异均有统计学意义(均P<0.05);男女性别的病原体型别的构成比差异无统计学意义(P>0.05)。郴州市的6株CVA16分离株均为B1基因亚型。结论 2014年郴州市的手足口病流行毒株显示了一定的季节性分布特征,主要的几种优势毒株相互交替流行,并与人群的免疫基础相互作用体现在月份和年龄组的分布上。郴州市的CVA16分离株与国内流行株的基因型别一致。

2010～2013年聊城地区肠道病毒A组CVA16型VP1基因特征及手足口病流行特点分析

目的对引起聊城地区手足口病（HFMD）流行的肠道病毒CVA16进行生物学分析,掌握其基因特征,为聊城地区手足口病的防控提供病原学资料。方法对2010~2013年聊城市各辖区采集手足口病患儿标本采用Real-time PCR法检测肠道病毒CVA16,用人横纹肌瘤（RD）细胞对核酸检测阳性标本进行病毒分离,对分离到的CVA16病毒分离株采用RT-PCR方法进行VP1区基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,利用DNAStar和MEGA 4.0分析软件进行同源性分析和构建系统进化树。结果 2010~2013年聊城市各辖区共送检手足口病标本862份,639份标本检测为通用肠道病毒核酸阳性,其中CVA16阳性标本181份,分离到109株毒株;对毒株进行基因序列分析显示,2010~2013年聊城市流行的CVA16病毒株为B1基因型,2010和2011年为B1a和B1b两种基因亚型共循环,2012和2013年为B1b型,不同毒株VP1区基因序列在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为91.0%~97.0%和98.3%~100%,与近源的亚型代表株相比,聊城市优势毒株的氨基酸变异一般发生在VP1第23位（L→M）。结论聊城市2010~2013年手足口病CVA16流行毒株为B1基因型,存在B1a、B1b两个基因亚型,同源性分析表明辖区部分CVA16分离株B1a亚型与我国台湾及周边国家的分离株关系较近,B1b亚型与来自国内北方分离株形成进化树上关系较近的一群。聊城市存在不同的传播链,流行的CVA16相对保守,但已出现一定程度的变异。

CVA16感染对m^6A甲基化相关蛋白表达和定位的影响

目的本研究旨在探究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)感染后是否会影响N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化相关蛋白在人呼吸道上皮细胞(16HBE)、ICR乳鼠和SCARB2人源化小鼠中的表达,以及在细胞中的定位。方法病毒分别以感染复数(MOI)=0.1感染16HBE和107 CCID50/ml感染小鼠,Western blot分析甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的表达变化,免疫荧光观察这些蛋白质在细胞中的定位。结果研究结果发现,随着CVA16病毒感染时间的增加,m6A甲基化相关蛋白在细胞中表达水平逐渐下调,在ICR乳鼠和SCARB2小鼠中无明显变化;病毒感染后,m6A甲基化相关蛋白在细胞核与细胞质中重新分布,甚至发生降解。结论CVA16在宿主细胞中复制时可以改变m6A甲基化修饰相关蛋白的表达和细胞定位。本研究结果提示m6A修饰可能是肠道病毒治疗的潜在新靶点。

微量细胞病变法检测健康人群EV71和CVA16中和抗体水平

目的了解深圳市福田区健康人群中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇A16型(CVA16)隐性感染情况。方法应用微量细胞病变法,对2011年和2012年一般人群流感抗体水平调查采集的471份血清标本进行EV71和CVA16中和抗体检测,并对检测结果进行统计学分析。结果 471份健康人群血清中EV71和CVA16中和抗体阳性率分别为25.50%和33.10%;EV71抗体由0～岁组的7.14%上升至15～岁组的42.65%(χ2=42.12,P<0.01),上升5.97倍,抗体几何平均滴度(GMT)呈缓慢上升趋势;CVA16抗体由0～岁组的9.18%上升至5～岁组的58.73%(χ2=61.87,P<0.01),上升6.39倍,抗体GMT呈波峰状;各年龄组两种抗体混合感染阳性率为11.25%(χ2=64.95,P<0.01)。结论本地区健康人群中存在肠道病毒隐性感染,各年龄组CVA16抗体阳性率均高于EV71;5～25年龄人群EV71和CVA16中和抗体阳性率、GMT和混合感染情况均高于其他年龄组,应加强5～25年龄人群的流行病学监测。

EV71和CVA16感染人呼吸道上皮细胞后参与免疫应答相关的microRNA和靶基因的分析

目的通过高通量测序分析肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)感染人呼吸道上皮细胞(16HBE)后差异表达的microRNA(miRNA)及其靶基因。方法利用TargetScan和miRDB两个数据库对两种病毒感染后同时上调或下调的miRNA靶基因进行预测,剔除在上调和下调中均出现的靶基因。对上调和下调表达的靶基因进行GO和pathway分析,筛选与免疫应答相关的GO和pathway中所包含的靶基因及其对应的miRNA,并进一步筛选同时参与免疫相关GO和pathway的上调或下调的靶基因及其对应的miRNA。挑选部分miRNA和靶基因进行qRT-PCR验证。结果筛选出上调miRNA对应的靶基因有598个,下调miRNA对应的靶基因有1311个,剔除了同时上调或下调miRNA的靶基因62个。参与免疫应答相关GO及pathway的上调靶基因分别是17个和13个,对应的miRNA分别是15个和17个。参与免疫应答相关GO及pathway的下调靶基因分别是58个和47个,对应的miRNA分别是30个和42个。将参与免疫应答相关GO和pathway的上调靶基因取交集,得到的靶基因有3个,对应调控的miRNA有4个。另外,将参与免疫应答相关GO和pathway的下调靶基因取交集,得到的靶基因有9个,对应调控的miRNA有13个。结论本研究有助于阐明EV71和CVA16感染后宿主——病原体的相互作用,并为手足口病的发病机制研究提供参考。

实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用分析

分析实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用效果。方法 选取本市各旗县区2022年01月-2022年12月间174例手足口病(轻型)患者作为观察对象,均予以实时荧光定量PCR检测(31份肛拭子,143份咽拭子),以RT-PCR法为参照标准,分析应用效果。结果 174例患者中,EV通用阳性81份,阳性率46.55%,其中CVA16分型阳性2份,阳性率2.47%,CVA6分型阳性76份,阳性率93.83%,CVA10、EV71分型肠道病毒未检出;实时荧光定量PCR阳性检出符合率与RT-PCR法相同,均为100.00%(P>0.05)。结论 实时荧光定量PCR检测应用价值较高,在手足口病肠道病毒快速检测中,灵敏度高,可推广。

湖北2013年部分柯萨奇A16型肠道病毒VP1基因分子特征分析

目的全面研究和了解2013年湖北省柯萨奇A16型的VP1基因特征,分析CVA16型病毒在我省的基因型别及分子进化分析。方法对2013年湖北省21株CVA16病毒流行株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析。结果2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为90.0%～100.0%和96.3%～100.0%。VP1区基因系统进化分析表明,湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上,分属于B1a和B1b基因亚型。结论 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要为B1b基因亚型,其次为B1a基因亚型,在同一地区有两种基因亚型的CVA 16病毒同时存在,在不同的地区存在同一种亚型的CVA16病毒。

2010～2012年北京市顺义区手足口病病原学检测结果分析

目的 通过对2010～2012年北京市顺义区手足口病（Hand-foot-and-mouth disease,HMFD）实验室检测结果分析,了解顺义区手足口病病原学特征,为手足口病防控工作提供科学依据.方法 对2010～2012年顺义区684例临床诊断为手足口病患者标本,应用实时荧光定量RT-PCR法检测标本中的肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVA16）、非EV71和CVA16的其它肠道病毒（EV）特异性核酸.结果 684例HFMD患者标本中,肠道病毒阳性率为47.37％ （324/684）.病原谱构成以CVA16型为主,占55.56％（180/324）,其次为EV71占32.41％（105/324）,其他肠道病毒占12.03％ （39/324）；4～7月为HFMD检出高峰期；0～5岁为高风险年龄组；性别比1.49∶1,男性阳性率略高于女性,但差异无统计学意义（x2 =0.163,P＞0.05）；散居病例阳性检出率较高.结论 2010 ～2012年顺义区HFMD病例病毒阳性检出率较高,CVA16是优势病毒型别；每年春夏季节,应加强对流动人口聚居区5岁以下儿童的手足口病防控工作.

盐城市2013年手足口病病原学特征分析

目的:对盐城地区2013年手足口病患儿及其临床重症病例进行病原学特征分析。方法:采集手足口病患儿咽、肛拭子,用肠道病毒实时荧光RT-PCR,对其病毒核酸进行肠道病毒检测定型。结果:491例(重症26例)患儿采集咽、肛拭子标本中,共检出肠道病毒核酸阳性193例(39.31%)中,EV71型35例(18.13%);CVA16型35例(18.13%),CVA6型96例(49.74%),其他未分型27例(13.99%)。临床重症病例14例中,EV71型3例,CVA16型0例,CVA6型9例,未分型2例,CVA6与EV71、CVA16三者发病比较,差异有统计学意义(χ2=8.0,P<0.01)。结论:检测的以往常见的EV71和CVA16型转变为CVA6型,它是引起重症病例的主要病原体,也是区域性手足口病的重要病原。

江苏省两县柯萨奇病毒A组16型流行病学特征分析

目的：探讨柯萨奇病毒A组16型（CVA16）的流行病学特征,以期为手足口病的综合防治和CVA16疫苗研制提供流行病学依据。方法：基于在江苏建立的肠道病毒所致疾病监测系统,通过主动与被动报告相结合的方式对东海县2 875人、宝应县2 080人进行监测;使用统一调查表格对病例进行个案调查,并采集咽、肛拭子进行实时荧光定量PCR法快速检测。结果：截至2013年2月,东海、宝应两县CVA16感染所致发病率分别为16.73%（481/2 875）和9.28%（193/2 080）,整个监测期间均只出现1个发病高峰,均在2012年5月中下旬;两县病例均覆盖所有乡镇,但不同乡镇间发病率存在地区差异;两县所发现病例年龄范围为9-42月龄,男、女性别比分别为1.59∶1和1.47∶1,不同性别发病率无统计学差异。结论：2012年3月-2013年2月江苏省东海和宝应两县肠道病毒流行以CVA16为主,病毒流行具有明显的季节性以及地区差异性。

2010～2012年上海市长宁区北新泾地区手足口病聚集性疫情特征分析

目的 对上海市长宁区北新泾地区2010～ 2012年手足口病聚集性疫情特征进行分析,为有效的预防措施和控制方法提供参考.方法 对2010～2012年北新泾地区的手足口病聚集性疫情的流行特征、处置情况、病原学检测结果进行分析.结果 2010 ～2012年北新泾地区共发生35起聚集性事件,包括1起暴发疫情和34起聚集性疫情,涉及病例占该地区报告病例的25.43％.发病高峰时间多在3～5月.所有疫情均进行了病原学检测,其中29起（83.69％）检出病毒阳性.以CVA16和EV71阳性为主.结论 2010 ～2012年北新泾地区聚集性疫情中的病毒阳性检出率较高,CVA16和EV71是主要病毒型别.3～5月是发病高峰,应加强对流动人口聚居区手足口病防控工作.

柯萨奇A组16型对不同细胞的敏感性研究

目的细胞是进行病毒分离时常被选用的基质,为了分离肠道病毒CVA16型,我们选取了两种细胞,从中筛选出肠道病毒CVA16型的最敏感细胞。方法将20份样本通过核酸检测确定其中的CVA16型阳性样本,通过对比RD、VERO这两种细胞的分离效果来比较细胞的敏感性。结果核酸检测20份样本中确定9份样本为CVA16型,9份样本在RD细胞中分离出6株毒株,在VERO细胞中分离出8株毒株。结论 CVA16型对VERO细胞的敏感性高于RD细胞,实验中分离CVA16型应首选VERO细胞。

儿童手足口病病原体的检测及致病影响因素研究

目的建立快速有效的手足口病病原体检测方法 ,并探讨手足口病病原体在儿童中的影响因素及防控措施。方法选择2015年3~11月在湖北大学医院感染科确诊的手足口病患儿为研究对象,从中随机抽取200例进行研究。本研究采用荧光定量RT-PCR方法对200份手足口病患者标本进行肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒普通组16型(CVA16)检测,同时,对病例进行Logistic回归分析来确定危险因素。结果 200例粪便标本检测共检出EV71和CoxA16阳性标本共计153例。其中,普通组感染46例,重型组感染66例,危重型组感染41例。EV71阳性标本感染91例,CoxA16阳性标本共78例。Logistic回归分析显示,在所有调查的影响因素中,体质弱、早产、病例接触史、居住环境差、个人卫生差5个为手足口病危险因素(P<0.05)。结论荧光定量RT-PCR方法具有特异性强,灵敏度高,重复率好的优点,非常适合手足口病病原体的检测;EV71病原体毒力更强,对患儿身体具有更大的破坏性,可引起严重并发症;儿童监护人应为儿童提供一个良好的居住环境和个人卫生,注意儿童膳食营养,避免与手足口病患儿接触,有相关症状应及时入院检查。

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化

[目的]原核表达并纯化柯萨奇病毒A组16型(CVA16) VP1蛋白。[方法]根据Gen Bank CVA16 VP1基因序列,合成VP1全基因,连接到载体p ET30a,构建原核表达质粒p ET30a-CVA16-VP1。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白。[结果]成功构建重组质粒p ET30a-CVA16-VP1,表达蛋白经SDS-PAGE显示分子量约为38.7 k Da,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白经复性、纯化,纯度达90%以上;经Western Blot检测,证实表达的蛋白为VP1蛋白。[结论]成功获得了高纯度的VP1蛋白,为此抗原用于临床诊断打下了基础。

手足口病毒和白细胞分类的探讨

目的探讨手足口病患儿血常规的特点及其在预测病情方面的价值。方法收集2015年4月-2018年7月四川绵阳四〇四医院诊断为手足口病患儿基本信息,以及他们在四川绵阳四〇四医院患病期间的血常规检测结果,主要是白细胞(WBC)、中性粒细胞(N)、淋巴细胞(L)和单核细胞(M),将肠道病毒71型(EV71)阳性、柯莎奇病毒A16型(CVA16)阳性与正常组的结果进行差异性分析,并采用受试者工作特征(ROC)曲线评价各指标对EV71阳性、CVA16阳性的预测价值。结果选取手足口病患儿7342例,病毒检出例数男性多于女性,以幼儿阶段(1~3岁)检出人数最多,学龄前阶段(>3~6岁)次之,各年龄段的检出率差异有统计学意义(P<0.05)。EV71和CVA16阳性者WBC、L和M较正常组升高(P<0.05),且CVA16组的M值高于EV71组(P<0.05)。L在EV71和CVA16中的曲线下面积(AUC)为0.865(95%CI:0.832,0.897)和0.865(95%CI:0.840,0.889),敏感性和特异性分别为73.42%、96.55%和75.22%、96.55%。M在EV71和CVA16的曲线下面积分别为0.617和0.672,敏感性和特异性分别为48.50%、93.10%和54.74%、93.10%。结论WBC、N、L和M对CVA16和EV71感染有一定的诊断指导价值,其中L的感染预测价值最高,M次之。在鉴别CVA16和EV71感染时,M具有一定的预测价值。