2010～2013年聊城地区肠道病毒A组CVA16型VP1基因特征及手足口病流行特点分析

目的对引起聊城地区手足口病（HFMD）流行的肠道病毒CVA16进行生物学分析,掌握其基因特征,为聊城地区手足口病的防控提供病原学资料。方法对2010~2013年聊城市各辖区采集手足口病患儿标本采用Real-time PCR法检测肠道病毒CVA16,用人横纹肌瘤（RD）细胞对核酸检测阳性标本进行病毒分离,对分离到的CVA16病毒分离株采用RT-PCR方法进行VP1区基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,利用DNAStar和MEGA 4.0分析软件进行同源性分析和构建系统进化树。结果 2010~2013年聊城市各辖区共送检手足口病标本862份,639份标本检测为通用肠道病毒核酸阳性,其中CVA16阳性标本181份,分离到109株毒株;对毒株进行基因序列分析显示,2010~2013年聊城市流行的CVA16病毒株为B1基因型,2010和2011年为B1a和B1b两种基因亚型共循环,2012和2013年为B1b型,不同毒株VP1区基因序列在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为91.0%~97.0%和98.3%~100%,与近源的亚型代表株相比,聊城市优势毒株的氨基酸变异一般发生在VP1第23位（L→M）。结论聊城市2010~2013年手足口病CVA16流行毒株为B1基因型,存在B1a、B1b两个基因亚型,同源性分析表明辖区部分CVA16分离株B1a亚型与我国台湾及周边国家的分离株关系较近,B1b亚型与来自国内北方分离株形成进化树上关系较近的一群。聊城市存在不同的传播链,流行的CVA16相对保守,但已出现一定程度的变异。

湖北2013年部分柯萨奇A16型肠道病毒VP1基因分子特征分析

目的全面研究和了解2013年湖北省柯萨奇A16型的VP1基因特征,分析CVA16型病毒在我省的基因型别及分子进化分析。方法对2013年湖北省21株CVA16病毒流行株进行VP1区全长基因序列测定,并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析。结果2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为90.0%～100.0%和96.3%～100.0%。VP1区基因系统进化分析表明,湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上,分属于B1a和B1b基因亚型。结论 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要为B1b基因亚型,其次为B1a基因亚型,在同一地区有两种基因亚型的CVA 16病毒同时存在,在不同的地区存在同一种亚型的CVA16病毒。

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及纯化

[目的]原核表达并纯化柯萨奇病毒A组16型(CVA16) VP1蛋白。[方法]根据Gen Bank CVA16 VP1基因序列,合成VP1全基因,连接到载体p ET30a,构建原核表达质粒p ET30a-CVA16-VP1。将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白。[结果]成功构建重组质粒p ET30a-CVA16-VP1,表达蛋白经SDS-PAGE显示分子量约为38.7 k Da,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白经复性、纯化,纯度达90%以上;经Western Blot检测,证实表达的蛋白为VP1蛋白。[结论]成功获得了高纯度的VP1蛋白,为此抗原用于临床诊断打下了基础。

CVA16感染对m^6A甲基化相关蛋白表达和定位的影响

目的本研究旨在探究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A 16,CVA16)感染后是否会影响N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化相关蛋白在人呼吸道上皮细胞(16HBE)、ICR乳鼠和SCARB2人源化小鼠中的表达,以及在细胞中的定位。方法病毒分别以感染复数(MOI)=0.1感染16HBE和107 CCID50/ml感染小鼠,Western blot分析甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白的表达变化,免疫荧光观察这些蛋白质在细胞中的定位。结果研究结果发现,随着CVA16病毒感染时间的增加,m6A甲基化相关蛋白在细胞中表达水平逐渐下调,在ICR乳鼠和SCARB2小鼠中无明显变化;病毒感染后,m6A甲基化相关蛋白在细胞核与细胞质中重新分布,甚至发生降解。结论CVA16在宿主细胞中复制时可以改变m6A甲基化修饰相关蛋白的表达和细胞定位。本研究结果提示m6A修饰可能是肠道病毒治疗的潜在新靶点。

手足口病常规检测方法改进分析

目的为提高RT-PCR的检出水平,进一步改进手足口病的检测方法提供参考依据。方法同时采用RT-PCR和real-time RT-PCR方法检测2011年2—5月河南省新乡市各级医院临床诊断为手足口病患者的100份粪便标本及50份非肠道病人粪便标本中肠道病毒通用型(PE)、柯萨奇病毒A组16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)核酸;改进引物,RT-PCR检测CVA16;在NCBI中对RT-PCR使用的各组引物进行BLAST比对,并使用Primer Premier 6.0及Oligo 6.62软件分析各引物。结果 Real-time RT-PCR法检出CVA16、EV71和PE阳性率分别为36%、33%和71%,常规RT-PCR法分别检出20%、27%和64%,2者的PE、EV71检出率无统计学差异,而CVA16的检出率差异有统计学意义(χ2=6.349,P<0.05);改进引物后,RT-PCR法CVA16阳性检出率提高到35%(χ2=5.643,P<0.05),与临床诊断的符合率增加10%,接近real-time RT-PCR检测水平;2种方法的特异性、漏诊率及误诊率无明显差异。结论常规RT-PCR法对CVA16的检出率较低,采用改进后的引物,其检出率达到real-time RT-PCR水平。

疑似重症手足口病病原学检测及流行病学分析

目的对2011年山东省滨州市采集的疑似重症手足口病病例样本进行实验室检测分析，从而为本地区手足口病的综合防治提供参考资料。方法采集2011年滨州市366例疑似重症手足口病病例的咽拭、粪便、肛拭样本，应用realtime RT—PCR技术检测肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVA16）、肠道病毒普通型（EV）。结果707份不同类型的样本中，粪便样本的检测阳性率最高，咽拭最低（P〈0．01）。366例疑似重症手足口病病例中，EV71病毒、CVA16病毒、非EV71和非CVA16的EV病毒阳性率分别为81．42％、4．64％、5．74％；病例人群男性高于女性（1．49：1），1岁-4岁年龄段病例数最多，5月-7月份为高发月份。结论EV71型是2011年本地区手足口病流行的主要致病病毒类型，其流行具有明显的年龄、季节性。