2016-2017年盐城市手足口病CVA9型肠道病毒VP1基因分子进化特征

目的研究2016-2017年盐城市手足口病病原CVA9型肠道病毒VP1基因分子进化特征。方法对2016-2017年盐城市疑似手足口病例标本进行病原体分子分型分析;以RT-PCR法扩增CVA9型肠道病毒VP1基因全长编码区并测序,采用生物信息学软件进行核苷酸及氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析。结果2016-2017年盐城市共检测1 002例疑似病例标本,肠道病毒核酸阳性率38.32%,主要型别为EV71型112例(占29.17%),CVA16型94例(占24.48%),其他肠道病毒共178例(占46.35%)。检出2株CVA9型,其核苷酸、氨基酸同源性分别为94.7%、99.3%,与原型株Griggs(D00627)核苷酸、氨基酸同源性分别为80.4%~81.3%、92.7%;与引起其他症状各代表株(包括无症状健康儿童携带者)的核苷酸、氨基酸同源性为81.1%~97.2%、94.0%~99.3%。遗传进化树分析显示2毒株在C4分支中构成2条明显的传播链:CVA9/JS-yancheng/122/2016位于单独的小分支,CVA9/JS-yancheng/419/2016与2016年无症状健康儿童携带者四川株(LC361283)聚集成簇构成另一传播链。共检测31例重症病例,13例肠道病毒通用核酸阳性,阳性率41.93%,其中EV71型11例、CVA型2例。结论2016-2017年盐城市引起手足口病的CVA9病毒属于散在流行,非手足口病流行的主要基因型别,与国内部分省市引起手足口病的毒株共进化共循环,与引起其他症状类型的CVA9毒株存在差异。

大肠杆菌O157∶H7 CVa9株O抗原变异的研究

目的 研究本实验室保藏的大肠杆菌O15 7:H7(E coliO15 7:H7)日本分离株CVa9O抗原的变异。方法 血清凝集试验检测CVa9菌株O和H抗原 ,区分O抗原变异株与非变异株。聚合酶链反应 (PCR)法分别检测O15 7和H7特异性基因。生化试验检测生化特性。观察菌株在麦康凯、山梨醇麦康凯、棉子糖麦康凯及ChromagarO15 7显色培养基上菌落形态 ,菌落计数法计算变异率。结果 抗 -O15 7抗血清与CVa9菌株进行玻片凝集试验出现强凝集 (CVa9- 8)和不凝集 (CVa9- 1、CVa9- 15 )两种菌落 ,试管凝集试验结果相同 ,证实不凝集菌落O抗原发生变异。抗 -HT 抗血清分别与变异株和非变异株H抗原进行试管凝集试验 ,均为强凝集。两种菌株O15 7和H7特异性基因均为阳性。变异株与非变异株生化特性基本相同 ,但变异株不发酵棉子糖。两种菌株在麦康凯及山梨醇麦康凯培养基上菌落形态特征没有区别。在ChromagarO15 7显色培养基上培养 4 8h ,变异株为浅紫红色 ,菌落周边呈毛边状 ,非变异株为紫红色 ,菌落边缘整齐。变异株在用棉子糖代替乳糖制备的棉子糖麦康凯培养基上菌落呈粉红色 ,非变异株呈红色。菌落计数显示变异率为 99 80 %。结论 CVa9菌株在保存过程中O抗原发生变异 ,菌落形态及部分生化特征亦有所改变。

2016—2021年云南省手足口病CVA9型肠道病毒VP1区基因分子进化特征分析

目的探讨2016—2021年云南省手足口病CVA9型肠道病毒VP1区基因分子进化特征,为手足口病的预防和控制提供科学依据。方法对云南省2016—2021年各州市采集的手足口病核酸检测阳性的病例标本进行病原分型分析,通过细胞培养,富集病毒后进行VP1区基因测序,采用DNA/Star软件进行核苷酸及氨基酸序列比对和基因进化特征分析。用Mega 5.2软件邻位相接法和Kimura 2参数法构建CVA9的基因进化树。结果云南省共分离到6株CVA9病毒株;CVA9毒株分布在4个州市,阳性病例均表现为轻症,年龄分布在7岁及以下年龄段,发病时间段主要集中在1—2月份。其中VP1区基因在11、12、18、84、132等位点氨基酸变化活跃。CVA9的10个基因组(A~J)之间的核苷酸差异率均大于15%,云南省分离的6株CVA9毒株分布在B基因组的G亚型。各CVA9株之间核苷酸、氨基酸差异率分别为15.75%~24.72%、1.39%~2.16%。云南省分离的6株CVA9毒株和国内云南、山东、浙江参考株遗传距离较近。结论2016—2021年引起手足口病的CVA9病毒散在流行,与国内部分省市引起手足口病的毒株共进化、共循环。

柯萨奇病毒A组9型的基因分型方法的建立

血清型别鉴定及基因分型分析是开展肠道病毒(Enterovirus,EV)分子进化特征研究的重要内容。目前为止,国内外对柯萨奇病毒A组9型(Coxsackievirus A9,CVA9)的研究主要集中在衣壳蛋白区的细胞受体结合位点及其基因特性分析,而基于全长VP1序列的基因型划分结果尚未明确。本研究依托国家手足口病监测网络,对2010-2019年全国31个省级行政区(省、自治区、直辖市)上送的18 238份手足口病样本中分离出的24株CVA9进行全长VP1区序列测定,并与GenBank中所有全长VP1区序列一起进行基因型划分研究。测序结果显示24株CVA9分离株VP1全长为906bp,编码302个氨基酸,与CVA9原型株(Griggs)核苷酸和氨基酸相似性分别为80.5%~97.6%和92.3%~99.6%。结合系统进化树和同一血清型内不同基因型的核苷酸差异界值为15%~25%,将全球CVA9划分为A-H八个基因型。进化树显示B、C和D基因型在病毒进化过程中已消失,而E、F和G基因型呈现共循环的趋势,其中G基因型包含了亚洲、北美洲、大洋洲和欧洲等9个国家的毒株,是CVA9的优势基因型。大部分中国株属于G基因型,与世界流行趋势一致。但在2018年新疆一例手足口病患儿体内分离到的CVA9毒株却与俄罗斯有很近的亲缘关系,被划分为F基因型,推测该毒株为俄罗斯输入株。CVA9虽具有明显的地理聚性,但G基因型中包含的多国家和多时间段的毒株也提示CVA9病毒可能存在远距离的传播和流行。

柯萨奇病毒A9型山东地方株的进化遗传学特征

柯萨奇病毒A9型(Coxsackievirus A9,CVA9)是常见的人类肠道病毒血清型,其感染可引起无菌性脑膜炎、脑炎等疾病。为探索其进化遗传学特征,本研究对山东省1991-2018年CVA9分离株的VP1完整编码区进行了序列测定,并与GenBank中获得的全球序列一并进行系统发生学和进化遗传学分析。结果显示全球CVA9可分为I-XII 12个基因型,优势基因型为VII,包括山东株在内的所有中国分离株均属于该基因型。进化遗传学研究显示,CVA9 VP1区序列的每年每个碱基的平均进化速率约为6.25×10^(-3),共同祖先起源于1919年。CVA9 VP1区的基因多样性在2003年以前无明显变化,2003年以后出现明显波动。本研究为我们了解CVA9的流行趋势和遗传变异提供了数据,对CVA9相关疾病的防控和诊断试剂的研发具有重要的现实意义。