CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用

目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP,探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法:PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒p DC316-GFP,将骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre和重组质粒p DC316-CXCR4-GFP共转染293细胞,产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增,扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定;real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达,筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞,检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒p DC316-CXCR4-GFP,与骨架质粒p BHG-lox-E1,3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光;PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×1013PFU/L;CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比,CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异,第5天细胞凋亡率明显增加,细胞活性明显降低,各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP,该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。

复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞CXCR4启动子活性的影响

目的:探讨复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞中CXCR4启动子活性的作用。方法:克隆人CX-CR4启动子序列,构建报告载体pGL4.17-CXCR4;转染HT-H9细胞株,G418筛选后分组,高、低剂量实验组分别用200、100mg/L大青液注射液处理,设注射水对照组、空白对照组和未转染对照组;各组处理24h后,进行荧光素酶活性检测。结果:成功构建含人CXCR4启动子序列的报告载体PGL4.17-CXCR4;5组荧光素酶活性比较差异有统计学意义(F=135.510,P<0.001)。复方大青叶注射液高剂量组与低剂量组荧光素酶活性均明显低于对照组(P<0.01)。结论:复方大青叶注射液能够有效抑制体外培养HT-H9细胞中CXCR4启动子活性。

CXCR_4启动子报告载体的构建

目的构建并鉴定含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的报告载体。方法采用克隆人CXCR4基因启动子的序列,构建报告载体Pg L4.17-CXCR4,以其转染Jurkat细胞,然后测定荧光素酶的活性。结果扩增得到的CXCR4启动子序列与克隆人Pg L4.17-CXCR4的CXCR4启动子序列和Gen Bank报道的一致。实验组荧光素酶的表达活性是874 809.020 0±39 510.624 6,与空白组的465.900 0±26.250 1和对照组的37 981.980 0±2 384.341 2总体比较差异有统计学意义(F=4 678.919,P<0.001)。结论按照本实验方案,含人CXCR4基因启动子的荧光素酶的Pg L4.17-CXCR4报告载体被成功构建。

大蒜素对Jurkat细胞CXCR4表达的影响

目的:探讨大蒜素对体外培养的Jurkat细胞中CXCR4启动子活性的影响。方法:克隆人CXCR4启动子序列,构建报告载体Pg L4.17-CXCR4,转染Jurkat细胞,G418筛选分组后,大蒜处理分高、中、低浓度3组(40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml),以未做任何处理的转染细胞作为对照组,以注射用水处理的转染细胞作为注射水对照组,各组处理24h后,在相应的条件下进行荧光素酶活性测定。结果:成功构建了含人CXCR4启动子序列的Pg L4.17-CXCR4报告载体,6组荧光素酶活性比较,差异有统计学意义(P<0.001),其中大蒜素处理组荧光素酶活性均低于对照组(P<0.001)。结论:大蒜素能降低CXCR4启动子的表达,有效抑制体外培养的Jurkat细胞中的CXCR4启动子活性。

穿心莲对人外周血CD4^+T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5的影响以及对CXCR4/CCR5启动子作用机制的研究

目的:探讨穿心莲对人外周血CD4+T淋巴细胞表面趋化因子受体CXCR4和CCR5的影响以及对CXCR4,CCR5启动子的作用机制。方法:健康志愿者口服含穿心莲内酯的穿心莲胶囊后,采集人外周静脉血并分离CD4+T淋巴细胞,RT-PCR、流式细胞术、Western-bloting检测服药前后人外周血CD4+T淋巴细胞表面CXCR4,CCR5的表达;采用报告基因技术,中药穿心莲提取物给大鼠灌胃后采集含药血清,将含药血清作用于转染有CXCR4,CCR5启动子载体的H9细胞株,检测穿心莲对CXCR4,CCR5启动子的影响。结果:健康志愿者口服穿心莲后,外周血CD4+T淋巴细胞表面CXCR4,CCR5 mRNA和蛋白表达水平较服药前显著降低;并且穿心莲能够显著降低体外培养细胞CXCR4,CCR5启动子活性。结论:穿心莲能够降低人外周血CD4+T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5的表达,具有潜在的抗HIV-1作用。