牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。

甘南牦牛CYGB基因第4外显子的多态性分析

为研究甘南牦牛CYGB基因第4外显子的遗传多态性及变异特征,本实验采用PCR-SSCP方法检测了300头甘南牦牛的CYGB基因。结果显示,甘南牦牛CYGB基因第4外显子存在AA、AB和AC 3种基因型,其基因型频率分别为0.800、0.100和0.100,由A、B和C 3个等位基因控制。序列分析表明,甘南牦牛CYGB基因第4外显子3'UTR区的等位基因B处发生了A→C突变;在外显子4的第25bp的等位基因C处发生了A→G突变,但该突变发生并未引起氨基酸水平的变化。统计结果表明,甘南牦牛CYGB基因呈低度多态,该牦牛群体处于平衡状态。

人脑星型胶质细胞瘤CYGB和p-ERK1/2及HIF-1α表达与临床病理特征和预后的关系

目的探讨细胞红蛋白(CYGB)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)及缺氧诱导因子1(HIF-1α)在人脑星形胶质细胞瘤中的表达与临床病理特点、肿瘤发生机制、治疗耐受及预后的关系。方法选取贵州医科大学附属医院2014-01-01-2018-08-30经病理确诊的120例Ⅰ~Ⅳ级星形胶质细胞瘤和20例脑出血患者病理组织标本。采用免疫组化法检测星形胶质细胞瘤中CYGB、p-ERK1/2和HIF-1α的表达;随访患者术后2年生存率;分析其与临床病理分级、分子遗传学表型及与预后的关系。结果CYGB的阳性率(Ⅰ级为70.0%,Ⅱ级为61.7%,Ⅲ级为46.4%,Ⅳ级为31.8%)随星形胶质细胞瘤分级升高而降低,χ^(2)=30.241,P=0.001;而p-ERK1/2(Ⅰ级为30.0%,Ⅱ级为39.1%,Ⅲ级为57.1%,Ⅳ级为65.9%)和HIF-1α(Ⅰ级为40.0%,Ⅱ级为50.0%,Ⅲ级为64.3%,Ⅳ级为77.3%)的阳性率随星形胶质细胞瘤分级升高而增加,χ^(2)值分别为17.143和23.578,P值分别为0.006和0.001。CYGB阳性患者2年生存率高于阴性患者(χ^(2)=13.617,P=0.001),而p-ERK1/2(χ^(2)=7.656,P=0.006)和HIF-1α(χ^(2)=11.305,P=0.001)阳性患者则低于阴性患者;此外CYGB阳性表达与p-ERK1/2(r=-0.315,P=0.001)和HIF-1α(r=-0.317,P=0.001)的阳性表达呈低度负相关。进一步发现CYGB的阳性表达与异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)R132H突变呈负相关,r=-0.368,P=0.032;p-ERK1/2阳性表达与DNA修复酶O^(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)的阳性表达呈正相关,r=0.408,P=0.016。Cox回归分析显示,CYGB低表达、p-ERK1/2和HIF-1α高表达是星形胶质细胞瘤的高病理分级及不良预后的高风险因素,HR分别为0.339、1.979和2.522,95%CI分别为0.236~0.674、1.186~3.303和1.412~4.506,P值分别为0.001、0.009和0.002。结论CYGB低表达与星形胶质细胞瘤的高级别病理分级及不良预后密切相关。与调控肿瘤细胞增殖的ERK1/2蛋白活化、缺氧感受蛋白HIF-1α的稳定以及IDH1的突变呈负相关。提示CYGB在星形胶质细胞瘤可能发挥抑癌基因的作用,其机制可能涉及缺氧感受及增殖信号的调控。其与ERK1/2及HIF-1α表达的联合检测为星形胶质细胞瘤的病理分级及判断预后提供了更加精准的联合检测方案。

重组大鼠细胞球蛋白的制备、纯化与活性

通过聚合酶链式反应(PCR)克隆鼠源细胞球蛋白(Cytoglobin,CYGB)基因,构建原核表达载体pET22b-Cygb,转入E.coliBL21(DE3)经乳糖诱导表达CYGB,发现CYGB主要以可溶形式存在,其表达量占可溶性总蛋白的35%以上.通过DEAE阴离子交换柱层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析,CYGB纯度可超过95%.重组表达的可溶性CYGB不但具有过氧化物酶活性,其活性为(3.23±0.12)mkat.(g.min)-1,还能保护胎鼠原代皮肤成纤维细胞减轻氧化应激损伤(H2O2模型).

稳定表达Cytoglobin的肝细胞株LO-2的建立及生长增殖的变化

目的:建立过表达细胞珠蛋白Cytoglobin(CYGB)的人肝细胞LO-2稳定株,初步探究CYGB对LO-2细胞生长增殖的影响.方法:采用PCR法扩增CYGB编码基因,并通过GATEWAY克隆技术构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;酶切、测序鉴定后,与包装质粒三质粒共转人肾上皮细胞(HEK293T),收集、浓缩含病毒上清,获得病毒颗粒;感染LO-2细胞并采用流式细胞分选技术筛选稳定细胞株,Western blot检测表达情况;使用CCK-8试剂盒检测过表达CYGB对LO-2细胞增殖的影响,通过流式细胞技术检测过表达CYGB对LO-2细胞凋亡的影响.结果:慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB双酶切鉴定以及基因序列比对鉴定均正确.三质粒共转HEK293T细胞后,荧光显微镜下观察大部分细胞出现绿色荧光;收集病毒颗粒并感染LO-2细胞后,经流式细胞分选技术筛选获得稳定表达CYGB的细胞,Western blot鉴定显示,LO-2稳定株组的CYGB表达条带明显,阴性对照组未出现条带.CCK-8法绘制的细胞生长曲线显示,稳定表达细胞组的细胞生长速率低于阴性对照组,有统计学差异(P<0.01).流式细胞技术检测各组LO-2细胞凋亡情况结果显示,稳定表达细胞组的细胞凋亡百分比高于阴性对照组(P<0.05).结论:成功构建慢病毒重组表达载体Plenti-N-GFP-CYGB;建立稳定表达CYGB的人肝细胞株LO-2-GFP-CYGB以及阴性对照组细胞株LO-2-GFP;稳定表达CYGB的肝细胞生长速率较阴性对照组肝细胞降低,稳定表达CYGB的肝细胞凋亡百分比高于阴性对照组肝细胞;为CYGB与其蛋白的相互关系研究提供了细胞模型.

胞红蛋白在调控细胞铁死亡中的作用

近年来,以细胞内氧化还原平衡失调为重要诱因,具有铁依赖性和以脂质过氧化物堆积引起细胞膜损伤为主要特征的细胞铁死亡备受关注。越来越多的研究表明,细胞铁死亡在疾病发生及防治方面具有重要作用。胞红蛋白(cytoglobin,CYGB),又名星状细胞激活蛋白(stellate cell activating protein,STAP),是一种珠蛋白,不仅能可逆地结合氧分子,储存和传递氧气,同时在其氨基酸序列中含2个半胱氨酸残基,可形成分子内部的二硫键,在感受细胞内氧化还原状态变动时,改变自身空间结构,引起生物活性及下游信号通路的变化。同时,CYGB还具有一氧化氮双加氧酶活性,能够清除过量一氧化氮与活性氧物质超氧阴离子反应生成的有毒ONOO~-,防止其对线粒体功能的破坏。而细胞内活氧物质和线粒体是影响细胞铁死亡的重要因素。因此,本综述主要围绕CYGB清除活性氧物质及调控一氧化氮代谢等的作用机制,并结合我们最近有关CYGB通过p53-YAP1轴调控细胞内脂质代谢的研究进行阐述,提出CYGB通过参与细胞铁死亡调控来行使功能,为心血管功能,肝纤维化及癌症发生等相关疾病的预防和治疗提供重要的理论依据。

siRNA对体外培养大鼠海马神经元细胞红蛋白基因表达的抑制

【目的】研究siRNA（small interfering RNA）对细胞红蛋白（Cytoglobin,CYGB）基因表达的抑制作用。【方法】取新生大鼠海马做神经元原代培养,NeuN免疫荧光抗体鉴定神经元纯度后,通过阳离子脂质体转染试剂将体外化学合成的针对CYGB基因的siRNA转入细胞中,以未转入siRNA细胞及转入阴性siRNA细胞为对照,通过转染荧光对照siRNA检测转染效率,用RT-PCR方法检测siRNA对CYGB表达的抑制作用。【结果】成功体外培养海马神经元,转染荧光对照siRNA结果示转染效率在70%左右,RT-PCR结果提示与阴性对照及空白对照相比,转染siRNA-78后24 h（P〈0.01）,48 h（P〈0.001）及60 h（P〈0.001）CYGB mRNA的表达明显减弱,72 h后表达无明显减少。而转染siR-NA-79,siRNA-80在各时间点与对照相比没有明显差别（P〉0.05）。【结论】特异性针对CYGB的siRNA-78转染体外培养的大鼠海马神经元24~60 h能显著下调CYGB基因的表达。

胞红蛋白表达纯化及抗氧化活性研究

研究人胞红蛋白(Cytoglobin,CYGB)的表达纯化、复性和抗氧化活性。人胞红蛋白基因工程菌pET28a/hC YGB/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,包涵体分离,复性,透析和Sephacryl S-200层析分离,获得纯化的rhC YGB。SDS-PAGE和HPLC检测表明rhC YGB纯度达95%以上,紫外光谱分析证明rhC YGB分子含有血红素,圆二色谱分析表明该复性蛋白质具有正确的α-螺旋结构。生化分析及细胞水平试验表明rhC YGB具有过氧化物酶活性和抗氧化活性。小鼠急性乙醇肝损伤模型试验表明rhC YGB能有效保护乙醇所致的肝损伤。研究结果表明经添加血红素复性和纯化所得的rhC YGB具有正确的空间结构和抗氧化活性。

携带GFP和FLAG标签的真核表达载体介导细胞珠蛋白在细胞内表达的定位研究

目的分别构建带有绿色荧光GFP标签和带有FLAG标签的细胞珠蛋白(CYGB)真核表达载体,观察其在人肝星状细胞(LX-2)的表达定位情况,探讨细胞珠蛋白经不同载体介导表达的定位差异。方法提取人肝癌细胞(HepG2)总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得CYGB的cDNA,以cDNA为模板采用PCR法扩增得到CYGB编码序列。将其酶切后分别连接至带有GFP标签和FLAG标签的载体上,酶切与测序鉴定阳性克隆。随后将重组质粒分别瞬时转染LX-2细胞,Western blot鉴定表达情况。利用细胞免疫荧光定位,在荧光显微镜下观察两组定位差异。结果双酶切和测序鉴定表明pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG真核表达载体构建成功;经Western blot鉴定,转染的两个载体都能够在LX-2细胞中表达融合蛋白;通过荧光显微镜发现,pEGFP-N1-CYGB和pcDNA3.0-CYGB-FLAG介导的表达产物分别定位在整个细胞和细胞质中。结论可能由于GFP分子量大等多种原因,导致带GFP标签的融合蛋白定位与带FLAG标签的定位不同,带FLAG标签的融合蛋白定位结果更加可信。

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。