正-丁苯酞在大鼠和人体内、外代谢产物的初步鉴定及与肝CYP450同工酶的相互作用

目的：对正-丁苯酞（n-Butylphthalide，NBP）进行系统的药物代谢和与药酶相互作用的研究。方法：采用稳定同位素示踪和LC-MS／MS相结合的技术，研究NBP在大鼠、人体外和体内的代谢产物，利用体外肝微粒体法配合体内实验鉴定了参与NBP代谢的CYP450同工酶类型，探讨其与CYP450主要同工酶之间的代谢性相互作用。结果：初步鉴定了NBP在人体外肝微粒体孵育液、尿液和血浆中的9种I相代谢产物及相关Ⅱ相结合产物，新发现NBP在大鼠体外肝微粒体孵育液、尿液和粪便中的7种I相代谢产物。大鼠和人体参与NBP代谢的主要CYP450同工酶是CYP2E、3A和2C；发现NBP在大鼠和人体内各产物的生成均由多个同工酶催化完成，同一种同工酶也参与了多个NBP产物的生成，但参与各个产物生成的同工酶的种类和比例略有不同。当大鼠体外NBP浓度达到50μM时对CYP2C有一定抑制作用，达到200μM时对CYP1A、2C和2D有一定抑制作用；人体外NBP浓度达到15μM时对CYP2C19有一定抑制作用；大鼠NBP灌胃给药160mg·kg-1（连续5日）和静脉给药20mg·kg-1（连续4日）对肝脏CYP450主要同工酶不存在具有临床意义的诱导和抑制效应。结论：本研究较全面地获得了NBP在大鼠和人体内的代谢途径信息，为安全、合理用药、预测药物代谢性相互作用，以及新药的进一步开发提供了有价值的参考依据。

温度对鲤CYP2E1同工酶活性的影响

为了探究温度对鲤CYP2E1同工酶活性的影响,本试验以氯唑沙宗(CZX)为探针药物探究不同水温(5、10、15、20、25、30℃)对鲤CYP2E1同工酶活性的影响。结果表明,CYP2E1同工酶的K_m值(以CZX作为探针)在反应温度为25℃时相对较低,其V_(max)(以CZX作为探针)在该温度时相对较高;反应温度对CYP450酶活性的影响能够间接反映水温对鱼类体内药物代谢的影响;可以推断鱼类在不同水温条件下药物动力学参数的差异主要是由于其CYP450酶在不同温度下的活性差异所造成的。

FB2与大鼠和人肝微粒体CYP450同工酶的相互作用

目的：FB2是新型Abl／Scr双重酪氨酸激酶抑制剂，拟用于治疗慢性髓细胞性白血病。本研究选择大鼠和人肝微粒体体外温孵系统，应用特异性探针底物法／抑制剂法，探讨参与FB2代谢的主要CYP450s以及FB2对CYP450s的抑制作用。

CYP3A29稳定表达HepG_2细胞株的建立及其硝苯地平代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪CYP3A29的HepG2细胞株。方法通过总RNA提取、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A29的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体PMD18-T上得到重组质粒pMD-3A29;以测序正确的重组质粒pMD-3A29为模板,采用PCR扩增CYP3A29基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHI/XhoI双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A29基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,并测序验证;将测序正确的CYP3A29基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,经RT-PCR及Western-blot分析及探针药物硝苯地平对重组细胞进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A29细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A29的HepG2细胞株,可用于相关药物代谢研究。

布格呋喃与大鼠肝脏药物代谢酶的相互作用

目的：研究参与布格呋喃代谢的CYP450同工酶类型和体外代谢的酶促动力学特征，并观察口服布格呋喃对大鼠肝脏药物代谢酶的影响。方法：采用比色／动态荧法光及UV—HPLC法检测大鼠口服布格呋喃（8mg·kg^-1·d^-1，连续3日）后肝脏CYP450同工酶（CYP1A2、2C6、2C11、2D2、2E1和3A2）和Ⅱ相酶-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDPGT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性。应用肝微粒体温孵法测定布格呋喃体外代谢速率（Vmax和米氏常数Km）。比较布格呋喃在正常及高诱导大鼠肝微粒体中代谢速率的差异以及CYP1A2、2C6、2C11、2D2、2E1和3A2的选择l生抑制剂（呋拉茶碱、磺基苯吡唑、奥美拉唑、奎尼丁、戒酒硫和酮康唑）对布格呋喃代谢的抑制程度，鉴定参与布格呋喃代谢的CYP450同工酶类型。结果：布格呋喃在乙醇、地塞米松和3-甲基胆葸诱导大鼠肝微粒体中的Km、Vmax分别为正常组的11倍、6倍和1.3倍；应用CYP3A2、2E1和IA2的选择性抑制剂酮康唑、戒酒硫和呋拉茶碱可不同程度地抑制布格呋喃的代谢，使代谢速率下降为对照组的34％、47％和78％。

痹祺胶囊配伍组分对体内CYP450同工酶活性的影响

目的通过体内实验评价痹祺胶囊配伍组方对细胞色素P450同工酶(cytochrome P450,CYP450)活性的影响。方法采用全新的"Cocktail"一点法,建立LC-MS/MS法测定大鼠体内5种探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、美芬妥英、右美沙芬和咪达唑仑及其相应的代谢产物的浓度,分析和评估痹祺胶囊配伍组分对大鼠体内5种CYP450酶的诱导和/或抑制作用。结果痹祺胶囊组方存在基于CYP450的配伍规律,与空白对照组比较,君药+臣药组、君药+使药组、君药+臣药+佐药组、君药+臣药+使药组、君药+佐药+使药组及痹祺胶囊全药组对CYP1A2具有显著诱导作用;君药+臣药组、君药+臣药+佐药组、君药+臣药+使药组及痹祺胶囊全药组对CYP2C9具有显著诱导作用。结论痹祺胶囊组方存在基于CYP450酶较显著的配伍规律,为进一步研究痹祺胶囊组方配伍的科学性和安全性奠定良好基础。

基于iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS研究黄连对CYP450同工酶表达的影响

黄连是临床常用药材,在中医药中被广泛应用,具有清热燥湿、泻火解毒之功,中药成分比较复杂,细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)同工酶是药物的主要代谢酶,研究黄连对CYP450酶的影响具有很重要的临床意义。实验选用大鼠肝脏组织,差速离心法分离肝微粒体,BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量,应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术结合2D-LC-MS/MS筛选差异蛋白。黄连一共鉴定出30个CYP450同工酶,7个表达上调,8个表达下调,15个没有发生变化。iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS可以全面研究CYP450酶,但黄连有必要进一步在体外水平对其进行评价,预防潜在的临床药物相互作用。

扶正化瘀方对正常及肝纤维化大鼠体内CYP450酶的影响

使用Cocktail探针药物法,研究扶正化瘀方(FZHY)对正常和肝纤维化大鼠细胞色素P450(CYP450)5种同工酶的影响。正常和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)腹腔注射诱导的肝纤维化模型大鼠,以FZHY浸膏粉连续灌胃2周后,单剂量尾静脉注射由CYP450 5种同工酶的特异性探针底物非那西丁(CYP1A2)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、奥美拉唑(CYP2C19)、氢溴酸右美沙芬(CYP2D6)和咪达唑仑(CYP3A4)配置的Cocktail探针溶液后,通过建立的LC-MS/MS法同时检测血浆中5种探针药物的浓度,采用PK solution 2TM对数据进行处理,并计算主要药动学参数。正常大鼠灌胃FZHY后,非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑和氢溴酸右美沙芬的AUC0-t均出现不同程度的增加,CL也均出现降低趋势,提示FZHY能明显抑制正常大鼠CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6的活性,但对CYP3A4的活性影响不明显;肝纤维化大鼠灌胃FZHY后,甲苯磺丁脲的AUC0-t显著增加,Vd显著降低,其他4种探针药物的药动学参数未见显著改变,提示在肝纤维化大鼠体内FZHY仅对CYP2C9有抑制作用,对CYP1A2,CYP2C19,CYP2D6,CYP3A4活性影响不明显。CYP450酶在肝纤维化条件下活性的改变可能是FZHY对正常和肝纤维化大鼠CYP450酶影响不同的原因。

那格列奈在大鼠游离肝细胞中的代谢特点

目的:研究新型非磺酰脲类降血糖药那格列奈(nateglinide)在大鼠游离肝细胞的代谢特点。方法:为考察该药的体外代谢和参与代谢的CYP450同工酶的种类,167μmol·L-1的CYP450同工酶抑制剂或底物(奎尼丁、磺胺嘧啶、奥美拉唑、普奈洛尔、西米替丁、左氧氟沙星、红霉素)和那格列奈在8×106个肝细胞·mL-1的混悬液中37℃时孵育60min,并于10,20,30,40,60min取样,HPLC法测定其中母体药物--那格列奈的浓度,并同空白对照组比较。结果:那格列奈的体外代谢迅速,10min内细胞悬液中原形药物仅占初始浓度的10％;奎尼丁、奥美拉唑、西米替丁能明显抑制那格列奈的肝脏代谢,使混悬液中母体药物浓度明显提高(P<0.01),磺胺嘧啶和普奈洛尔的加入,也使母体药物浓度显著提高(P<0.05)。结论:CYP450同工酶CYP2D6和CYP2C9在那格列奈羟化过程中起重要作用。CYP1A2,CYP2C19和CYP3A4同工酶是否参与代谢尚需进一步实验研究。

细胞色素P450酶诱导模型的建立及其应用

目的:本研究使用原代培养的人肝细胞建立细胞色素P450的酶诱导模型,并使用该模型研究柚皮素和贯叶金丝桃素对P450酶的诱导作用。方法:本研究是将冷冻的原代人肝贴壁细胞进行接种培养,使用不同诱导剂分别对CYP1A2,CYP2B6和CYP3A4进行诱导,建立测定mRNA表达水平的Real-time PCR方法,通过测定CYP450酶mRNA表达水平来评价药物对P450酶的诱导作用。结果:3批次的诱导结果表明奥美拉唑、苯巴比妥钠、利福平均能分别显著诱导CYP1A2,CYP2B6,CYP3A4的表达,表现出对应的mRNA表达水平明显增加(均>4);阴性对照乳糖酸红霉素对CYP1A2,CYP2B6,CYP3A4 mRNA表达水平未见明显影响。柚皮素在1,3和10μmol·L^(-1)浓度给药时,对CYP1A2,CYP2B6和CYP3A4 mRNA表达水平未见明显影响;贯叶金丝桃素在1,3和10μmol·L^(-1)浓度给药时,对CYP3A4 mRNA表达水平明显增加(均>4),对CYP1A2和CYP2B6 mRNA表达水平未见明显影响。结论:数据表明本诱导模型建立成功,柚皮素在1,3和10μmol·L^(-1)浓度给药时对CYP1A2,CYP2B6和CYP3A4没有诱导作用,贯叶金丝桃素在1,3和10μmol·L^(-1)浓度给药时对CYP1A2和CYP2B6没有诱导作用,对CYP3A4有诱导作用。

抗乙肝候选新药替芬泰对细胞色素P450酶的体外抑制和诱导作用研究

抗乙肝候选新药替芬泰(Y101)是一类苯丙氨酸二肽衍生物,有全新的抗乙肝病毒机制和良好的抗乙肝病毒作用。本文应用基于荧光测定的高通量细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)抑制筛选试剂盒,通过测定所得的荧光强度值,计算剩余酶活性及半数抑制浓度(IC50),评估Y101对CYP同工酶的抑制潜能,结果表明Y101对CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6产生抑制作用的可能性较小(IC_(50)均大于100μmol·L^(-1))。人原代培养肝细胞中加入Y101培养72 h,以"Cocktail"法混合加入CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的探针底物进行反应,液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法同时测定上述探针底物经CYP同工酶代谢的代谢产物浓度,计算CYP同工酶的剩余酶活性。实验组与空白对照组相比的酶活性比值均小于1(在0.662~0.928之间),与阳性对照组相比均小于其诱导能力的40%,结果表明Y101对CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4无诱导潜能。结果表明,Y101可能不会在联合用药的过程中发生基于CYP酶抑制或诱导的代谢性相互作用。