PCR-ACRS方法筛查CYP21基因P459H的突变位点

目的:研究21-羟化酶基因(CYP21)第10外显子P459H突变(CCC→CAC)在正常人群中的发生率,分析P459H是点突变还是基因多态。方法:设计特异性引物扩增CYP21基因3-10外显子,PstⅠ限制性内切酶消化验证PCR产物为特异性扩增,在此基础上,应用PCR结合扩增引进限制性酶切位点方法(PCR-ACRS)扩增首次PCR产物,FspⅠ限制性内切酶酶切后用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳筛查第10外显子P459H的发生率。结果:100例正常人CYP21基因第10外显子密码子459均为CCC,即均未出现P459H变异。结论:CYP21基因P459H为点突变,排除基因多态的可能;另外,PCR-ACRS是一种快速、可靠的检测基因点突变的有效途径。

河南地区21-羟化酶缺乏症患儿CYP21A2基因突变谱分析

目的探讨河南地区21羟化酶缺乏症(21-OHD)遗传特征。方法回顾分析2009—2016年,祖籍河南,汉族,临床诊断为21-OHD患儿及其家系的基因检测结果。应用Sanger测序和MLPA方法进行21羟化酶基因CYP21A2检测,对于CYP21A2基因突变呈阴性的患儿,再进行二代测序以明确诊断。结果共54个家系55例患儿,病程1个月～8年,其中临床诊断失盐型49例(男37例、女12例),单纯男性化型6例(女3例、男3例)。46例患儿检测到CYP21A2基因突变,突变频率依次为c.293-13A/C>G(I2G)、全基因缺失或大片段缺失、C.955G>T(p.Q319X)、C.515T>A (p.I172N)、c.1069G>T(p.R357W)。9例CYP21A2检测阴性者,二代测序检测到NROB1(DAX1)7例,更正诊断为先天性肾上腺发育不良。结论河南地区临床诊断21-OHD患儿CYP21A2最常见热点突变类型是c.293-13A/C>G(I2G),其次为基因大片段缺失。

两种新复合型CYP21A2突变致单纯男性化型21羟化酶缺陷症

目的分析2例单纯男性化型21羟化酶缺陷症(21-OHD)患者的临床表现、实验室检查和遗传学资料。方法通过患者临床表现、实验室检查及影像学资料确诊,对CYP21A2基因直接测序的方法寻找致病突变位点。应用在线蛋白质功能预测软件预测新突变的功能。结果 2例患者均为单纯男性化型21OHD,激素测定提示ACTH、醛固酮、睾酮、雄烯二酮等明显高于正常水平;双侧肾上腺增生。基因测序发现,CYP21A2基因在一例为复合型纯和突变(H62L和V69L),另1例为复合型杂合突变(I2g和10InsL)。在国内该两种复合型突变尚未见报道。V69L为中国人中特有的突变,在线蛋白质功能预测软件提示其极有可能损害蛋白质功能。结论在CYP21A2基因上发现的两种复合型杂合性突变可能与单纯男性化型21OHD的发生有关。

定点突变法确定人体CYP2A6和CYP2A13香豆素代谢的关键氨基酸

【目的】通过比较人体主要尼古丁代谢酶CYP2A6和CYP2A13野生型及突变体酶蛋白对香豆素7-羥化反应的催化动力学特征,确定影响两者催化活性差异的关键氨基酸残基,提供建立评估人群尼古丁代谢酶基因多态性与吸烟行为及癌症易感性生物标记的依据。【方法】运用定点突变和Sf9昆虫杆状病毒蛋白表达体系产生CYP2A6和CYP2A13在300,301以及369位点氨基酸互换的突变体蛋白质,测定系列香豆素浓度下的各个酶蛋白对香豆素7-羥化的催化反应活性,获得动力学参数并与野生型酶蛋白进行比较分析。【结果】与野生型CYP2A6相比较,其Ile300→Phe突变体催化效率(Kcat=Vmax/Km)显著下降而Gly301→Ala突变体催化效率显著上升(1.64和8.02相对于野生型3.56,P<0.01)。与之相对应,CYP2A13的Phe300→Ile突变体催化效率则明显上升而Ala301→Gly突变体催化效率显著下降(1.03和0.06相对于野生型的0.27,P<0.05)。这些酶催化特性的改变,主要是由于Vmax的改变所致。369位的氨基酸残基,无论是Ser还是Gly对CYP2A6或CYP2A13的香豆素7-羥化反应催化活性均无明显的影响。【结论】300和301位的氨基酸是影响CYP2A6及CYP2A13对香豆素7-羥化反应催化活性的关键残基,而369位氨基酸不影响此活性。

CYP21A2基因复合杂合突变及多基因突变的男性无精症一例并文献复习

CYP21A2基因突变可引起21-羟化酶缺乏症,导致先天性肾上腺皮质增生症和性腺发育异常。根据CYP21A2基因突变位点不同,21-羟化酶缺乏症的临床表型存在异质性,成年患者常以生育障碍为首诊原因。CYP21A2基因突变同时合并多基因突变的复杂病例,国内外尚少见报道。报道1例CYP21A2基因c.518T>A/c.293-13A>G复合杂合突变的男性无精症病例,该患者合并DNAJB13/DNAI1/QRICH2J/FSIP2/HYDIN多基因突变,临床表型为男性不育症,经3个月糖皮质激素治疗后获得生精功能。该病例丰富了有关男性不育症的基因型,也为此类复合杂合基因突变疾病的诊治提供了临床经验。

一种新复合杂合突变导致21-羟化酶缺陷症

目的探讨1例单纯男性化型21-羟化酶缺陷症(21-OHD)基因突变的类型和特点及临床表型与基因突变类型之间的关系。方法收集患者的临床资料,提取外周血白细胞DNA,用PCR方法扩增CYP21A2基因的10个外显子及内含子边界,测序鉴定CYP21A2基因突变位点,进一步分析突变位点与临床表型的关系。结果患者的临床表现主要为外阴发育异常。基因测序结果显示为复合杂合突变,其一个等位基因为c.515 T>A,p.I172N,另一个等位基因为c.593 T>G,p.L198X,此种复合杂合突变主要引起单纯男性化表现。p.L198X是至今尚未见报道的一种新突变。结论发现了CYP21A2基因一种新的突变p.L198X,丰富了CYP21A2基因突变数据库。同时从分子遗传学方面证实了对患者的诊断,患者基因型能很好地解释其临床表现。

新复合杂合基因突变致非经典21-羟化酶缺陷症1例报告并文献复习

目的 报道1例非经典21-羟化酶缺陷症(21-hydroxylase deficiency, 21-OHD)患者的基因类型,丰富该类疾病的遗传数据库。方法 收集我院收治的1例非经典21-OHD患者临床资料,结合基因测序结果,以明确诊断。采集其亲属外周血,针对CYP21A2进行高通量基因测序,并结合相关文献进行复习。结果 患者,女,16岁,临床表现为阴蒂肥厚,无月经来潮,多毛、痤疮,青春前期身体呈生长加速现象,骨龄提前。基因检测结果显示,CYP21A2基因有两个复合杂合变异[错义突变c.1451G>A(p:R484Q),缺失突变deletion exon 1~3]。通过对其家系进行测序,发现错义突变c.1451G>A(p:R484Q)来自于其外祖父及母亲,而缺失突变deletion exon 1~3来自于其祖母和父亲。结论 发现了1例新复合杂合基因突变致非经典21-羟化酶缺陷症患者,丰富了21-OHD致病突变数据库,有助于提高临床医师对该病的认识。

携带I172N和R483框移突变的21-羟化酶缺乏症1例及文献复习

目的分析1例单纯男性化型21-羟化酶缺乏症(21-OHD)基因突变特点与临床表型的关系,探讨其激素治疗的必要性。方法收集患者的临床资料,提取患者外周血DNA,用PCR扩增和DNA测序方法鉴定CYP21 A2基因突变位点,并与NCBI网站和人类细胞色素P450(CYP)相关的CYP21A2基因突变数据库比对,进一步分析患者基因突变特点与临床表型的关系。结果患者主要表现为外生殖器男性化和声音低沉。基因测序结果显示为复合杂合突变,一个等位基因为T518A突变,导致1172N错义突变;另一个等位基因为1451-1452GG→C突变,导致R483框移突变,这是至今报道很少的一种罕见突变。这种复合杂合突变主要引起单纯男性化表现。结论 R483框移突变是CYP21A2基因的一种罕见突变,从分子遗传学方面证实了对患者的诊断,也很好地解释了患者的临床表型。对于育龄期女性患者激素治疗更有必要性。

非经典型21-羟化酶缺乏症1例基因分析并文献复习

目的分析非经典型21-羟化酶缺乏症的临床表现和病例自身及子代基因型特点。方法分析2014年7月本院内分泌科诊断的1例非经典型21-羟化酶缺乏症伴肾上腺占位患者的临床特点、诊疗结果以及基因测序,并结合文献进行回顾性分析。结果患者女性,37岁,月经不规律,查体示上部量79 cm,下部量73 cm,体型肥胖,有轻微男性化表现,阴蒂肥大。CT示左侧肾上腺占位,实验室检查提示高雄激素血症、高胰岛素血症,17-羟孕酮>20 ng/ml,睾酮4.11 nmol/L。中剂量地塞米松可抑制17-羟孕酮且使睾酮轻微下降。家族中哥哥身材矮小,女儿出现阴蒂肥大表现,可支持诊断为先天性肾上腺皮质增生:非经典21-羟化酶缺乏症。基因测序分析发现患者及其子代均存在与非经典21-羟化酶缺乏症相关的基因突变(CYP21A2:P030L,I172N等)。结论高雄激素血症伴有肾上腺增生或存在肾上腺占位的患者应常规筛查17-羟孕酮,对非经典21-羟化酶缺乏症患者后代进行基因筛查可早期诊断疾病。

21-羟化酶缺乏症患者CYP21基因点突变研究

目的 了解CYP2 1基因编码区的常见突变谱和突变热点 ,并分析基因型和表现型的关系。方法 对来自 51个家庭的 52例 2 1 羟化酶缺乏症患者的全长CYP2 1基因分两个片断进行特异性聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,在此基础上进行相应的巢式PCR扩增 ,再根据突变的特点分别采用限制性片段长度多态性 (RFLP)和扩增产生酶切位点 (ACRS)的方法 ,检测 6种突变 :P3 0L、I2g(内含子 2的nt 656a/c→g剪切突变 )、E3Δ8nt(外显子 3第 111～ 113密码子的 8bp缺失 )、I172N、V2 81L和Q3 18X。结果 在 10 2个等位基因中 ,除了 2 7个等位基因外都能够确定基因型。最常见的突变为I2g ,其发生频率为 3 1% ,其次为I172N( 2 3 % ) ,Q3 18X( 14 % ) ,V2 81L( 9% ) ,P3 0L( 3 % ) ,E3Δ8nt( 2 % ) ,其中有 2个以上复合突变的等位基因占 6%。失盐型患者最常见的突变为I2g( 4 5 7% )和Q3 18X( 2 6% )。单纯型最常见的突变为I172N( 4 0 7% )和I2g( 18 5% )。结论 本组 52例患者中 73 %的等位基因突变为上述 6种突变 ,以I2g和I172N为突变热点 ,2种突变占 54%。

扩增引进限制性酶切位点技术对两种CYP21基因突变的检测

目的 建立一种快速、可靠的 CYP2 1基因突变的检测方法。方法 收集 50例 2 1-羟化酶缺乏症患者及部分先证者家系的外周血 ,并提取 DNA。用计算机软件 (DNAssist)对 CYP2 1基因突变相应的限制性内切酶的酶切位点进行分析 ,使用 PCR结合扩增引进限制性酶切位点的方法对没有酶切位点改变的 I172 N和 R3 56W两种 CYP2 1基因突变进行检测。结果 有 2 1例患者发现 I172 N突变 ,其中 3例纯合子 ,18例杂合子 ;8例患者发现 R3 56W突变 ,皆为杂合子表现 ,其发生频率与文献报道的相似。并且通过I172 N和 R3 56W两种突变的各 5个家系分析 ,皆符合常染色体隐性遗传的特点。结论 以 PCR为基础的扩增引进限制性酶切位点法简便、可靠 ,是快速检测 CYP2

21-羟化酶缺乏症CYP21A2基因突变及表型分析

目的探讨天津及周边地区21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因突变谱,分析基因型与表型的相关性。方法收集先证者外周血,提取基因组DNA,联合应用位点特异性PCR、PCR扩增产物直接测序以及多重连接依赖探针扩增技术对致病基因CYP21A2进行检测并分析基因型与临床表型的关系。结果(1)在35例21-羟化酶缺乏症患儿中,25例为失盐型,10例为单纯男性化型。(2)在35例先证者70个等位基因中共检测出69个突变等位基因,除1例只检出1个突变等位基因外,其他患者均检测出2个突变等位基因,突变检出率为98.6%。(3)共检出6种突变,其中c.293-13C/A>G(12G)最为常见,占57.1%(40/70),其次为大片段缺失或基因转换,占18.6%(13/70),第三是p.I173N,占14.3%(10/70)。另外还检出了一个国内外均未报道过的新突变c.949C>T(p.R317X),为致病性变异。(4)对35例患儿进行基因型与表型相关性分析,结果显示31例患儿依据基因型预测的表型与实际失盐表型一致,3例患儿与实际临床表型不一致。结论天津及周边地区21-羟化酶缺乏症患者CYP21A2基因突变特点与国内其他地区报道略有不同,其中c.949C>T尚未见报道,这丰富了21-羟化酶缺乏症致病基因CYP21A2的突变谱,为遗传咨询及产前诊断奠定了基础。

扩展细胞色素P4502A6对大位阻底物的适应性

细胞色素P450酶(P450)的分子改造及其催化的生物转化是当前的两个研究热点.本研究以扩展P4502A6的底物适应性为目标,通过尝试对P4502A6酶进行N-端修饰提高表达量、筛选随机突变库以及点突变改变活性位点重要氨基酸残基等手段,在两个随机突变体中未筛选到功能突变体,但通过点突变重要氨基酸残基获得了新的突变体P4502A6(N297Q/I300A).该突变体具有比野生型和已报道的其它突变体更广泛的底物适应性,能够催化氧化大位阻底物6-苄氧基吲哚(6-OBzl-indole)生成蓝绿色物质.该物质经质谱测定为靛蓝类二聚体化合物.实验表明,其中两个氨基酸残基的变化都是关键突变,此结果与最新的P4502A6突变体晶体结构研究相符.计算机模拟显示,I300A突变导致活性口袋在铁卟啉环的垂直和水平方向都增大,使其能接纳在两个方向都有位阻的底物;而297位的天冬酰胺是一个功能保守的残基,N297Q的变化可能与氢键等弱作用有关.

相同CYP21A2基因突变(I2g)致3种不同表型的21-羟化酶缺陷症

目的分析3例21-羟化酶缺陷症(21-OHD)患者的病史、临床表现、实验室检查和基因突变的关系。方法通过患者病史、临床表现、实验室检查及影像学资料诊断21-OHD,通过对CYP21A2基因进行分析,寻找致病突变位点。结果 3名患者均确诊为21-OHD。基因测序发现CYP21A2基因均存在相同致病基因突变(I2g),但病史、临床表现及激素测定结果提示3例患者分别为失盐型、单纯男性化型、非经典型。结论相同CYP21A2基因突变(I2g)可存在于不同表型的21-OHD中,相同基因不同表型的机制值得进一步研究。

青岛市21-羟化酶缺乏症患儿基因突变程度与初始生化指标及治疗效果的关系研究

目的分析21-羟化酶缺乏症CYP21A2基因不同突变程度的初始治疗效果的差异性,为临床诊治及预后提供依据。方法回顾性分析2010年1月—2023年7月期间在青岛市新生儿疾病筛查中心筛查并基因确诊的34例患者的临床资料,联合应用多重链接依赖探针扩增技术及Sanger测序对致病基因CYP21A2进行检测,根据CYP21A2基因突变的残留酶活性,分为5个不同的基因型组:Null组(酶活性=0)、A组(酶活性<1%)、B组(酶活性2%~11%)、C组(酶活性约20%~50%)、D组(酶活性未知),探讨基因不同突变程度之间诊治指标的差异性。结果1)除外大片段缺失,34例患者中基因突变发生在内含子2区(29.82%)、第4外显子(28.07%)、第10外显子(12.28%)的比例较高,且第10外显子发生的突变种类较其他地区多。2)除外D组3例患儿(酶活性未知),本研究31例患儿的基因型-表型阳性预测值为90.32%。3)Null组、A组患儿均在1月内开始治疗,Null组、A组、B组、C组开始治疗的时间(H=11.568)、孕酮(H=13.864)、睾酮(H=13.249)、钠离子(H=17.370)、钾离子(H=19.613)、17-羟孕酮浓度(H=10.720)差异均有统计学意义(P<0.05);4个基因组间17-羟孕酮恢复正常时间、初始氢化可的松用量差异无统计学意义(P>0.05)。结论青岛地区34例患者的基因突变易发生在内含子2区、第4外显子、第10外显子,且第10外显子发生的突变种类较多。基因型-表型具有良好相关性,随酶活性降低而降低。基因突变程度对开始治疗的时间、17-羟孕酮、雄激素、电解质有显著影响,对17-羟孕酮恢复正常的时间、初始醋酸氢化可的松药量无显著影响。

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。

女性21-羟化酶缺陷症三例临床特点及基因诊断分析

目的探讨女性21-羟化酶缺陷症(21-OHD)的临床特点及基因诊断。方法比较分析2011年12月至2014年4月期间就诊于南京市妇幼保健院的3例女性21-OHD患者的临床资料和基因检测结果。结果临床表现:3例均有高雄激素体征、不孕,2例有月经异常、终身高矮;内分泌检查结果提示:3例血清雄激素水平、17-羟孕酮(17-OHD)和孕酮升高;2例皮质醇降低,促肾上腺皮质激素(ACTH)升高;基因诊断结果:2例单纯型21-OHD,1例非经典型21-OHD单发突变(单纯型)。通过糖皮质激素治疗后血清雄激素水平下降,3例均获正常月经,2例成功妊娠,1例已分娩。结论由于基因突变位点不同,女性21-OHD临床表型具有差异性,非经典型21-OHD易与多囊卵巢综合征(PCOS)混淆,基因检测是诊断的金标准,有助于早期筛查及有效治疗。

33例成人单纯男性化型21-羟化酶缺陷症的临床特点与基因型研究

目的提高对成人单纯男性化型21-羟化酶缺陷症(21-OHD)的认识。方法收集2015年1月至2018年3月期间就诊上海交通大学医学院附属第九人民医院的33例单纯男性化型21-OHD患者,对其临床资料及基因型进行分析。结果33例患者就诊年龄为(26.3±6.5)岁。33例中,染色体核型为46 XX者29例,46 XY者4例。临床表现主要为身材矮小(100%),染色体核型46 XX者主要表现为阴蒂肥大或小阴茎(26/29,89.65%)、原发性闭经(26/29,89.65%)、乳房未发育(24/29,82.76%)、声音变粗(16/29,55.17%)等男性化症状。90.9%的患者初诊时血清17-羟孕酮(17-OHP)、93.9%患者雄烯二酮(AD)、91.2%患者睾酮明显升高。CYP21A2基因测序发现13种突变,其中最常见的突变类型I173N,占40.00%,I2G占18.33%;4例患者存在CYP21A2基因的多位点突变。结论单纯男性化型21-OHD患者以身材矮小、阴蒂肥大或小阴茎、原发性闭经为主要的表现,17-OHP等激素水平检测对于该型的诊断及疗效的监测有重要意义,I173N、I2G两种突变是本组患者最常见的突变类型。临床认知有限、诊断年龄晚是导致患者最终身高缺陷的主要原因。

男性化型21羟化酶缺陷症患者一例的临床分析与基因研究

目的分析一例男性化型21羟化酶缺陷症患者的临床特点,并明确其21-羟化酶(21-hydroxylase,CYP)基因的突变位点。方法收集一例男性化型21羟化酶缺陷症患者的临床资料,对其外周血DNA进行聚合酶链反应(PCR)及亚克隆,并将产物割胶纯化后进行测序,对CYP21基因进行分子检测,并在192例正常人中进行验证。结果测序结果显示该患者内含子B上2333位点C→A,同时由于真假基因融合,导致了CYP21A2基因编码区第1外显子1793T→C(L39L),1813T→C(L45L),1817T→C(Y47H)。结论经基因检测证实患者第1外显子存在Y47H突变,该突变类型目前国内外尚未见相关报道,丰富了CYP21A2基因突变数据库,同时从分子遗传学方面证实了对患者的诊断。

先天性肾上腺增生症1例

目的:探究先天性肾上腺皮质增生症(CAH)患者1例及亲属的CYP21A2点突变情况。方法:收治CAH(21-OH D失盐型)患儿1例,采集患儿外周血并对其家系父母亲及两位姐姐也采集外周血,进行PCR扩增采用DNA聚合酶,直接测序扩增产物,检测CYP21A2点突变。结果:患者的突变IVS2-13位置>G的纯合变异、550-8T>C杂合变异。其父亲CYP21A2基因第7号外显子重复变异;其母CYP21A2基因第1~6号外显子重复变异。结论:根据患儿的临床症状应考虑CAH的诊断,有条件可联系做基因检查确诊。