体内、体外相结合评价CYP2E1酶活性的方法学研究

目的:以氯唑沙宗(chlorzoxazone,CZX)为"探针药物",建立一种快速、准确的体内、体外相结合评价细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)酶活性的HPLC-DAD检测方法。方法:体内实验为大鼠静脉注射CZX,剂量20 mg.kg-1,按时间点眼眶取血,检测CZX与其代谢产物6-羟基氯唑沙宗(6-hydroxy chlorzoxazone,6-OHCZX)的血浆药物浓度。体外实验为不同浓度CZX与大鼠肝微粒体温孵后,检测温孵体系中6-OHCZX的浓度,计算酶动力学参数来评价CYP2E1酶的活性。采用Agilent Extend-C18色谱柱(6 mm×100 mm,5μm),以非那西丁为内标,流动相为乙腈-0.6%乙酸水溶液,流速1.0 mL.min-1,紫外检测波长290 nm,柱温30℃。结果:体内、体外实验结果发现CZX,6-OHCZX的线性范围、日内和日间精密度、相对回收率、稳定性均符合生物样品的检测要求。结论:大鼠血浆及肝微粒体温孵体系中的其他内源性物质不干扰待测物的测定。该方法快速、稳定、灵敏度高,适合CZX及其代谢产物6-OHCZX的测定。

CYP2E1 Ras I基因型对苯酚诱导的酶活性和DNA损伤作用的影响

[目的]研究3种CYP2E1 Ras I基因型对苯酚诱导永生化人淋巴细胞的CYP2E1酶活性及DNA损伤作用的影响。[方法]加入不同浓度的苯酚对CYP2E1 Ras I不同基因型的永生化人淋巴细胞进行24～72 h染毒,采用四甲基偶氮唑蓝法(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)测定细胞毒性并确定苯酚染毒剂量;采用苯胺分光光度法测定CYP2E1酶活性;采用单细胞凝胶电泳(SCGE)法测定DNA损伤作用。[结果]0．05％苯酚24 h染毒对CYP2E1 Ras I野生、杂合及突变基因型细胞均产生生长抑制作用,苯酚对细胞24～72 h染毒的最大无作用浓度为0．01％。各基因型细胞经一定浓度苯酚诱导后酶活性升高(P<0．05),其中野生型细胞经0．005％和0．01％浓度的苯酚染毒可出现酶活性增高的效应,突变型和杂合型细胞经0．01％浓度染毒可出现酶活性增高的效应,且染毒72 h时,在0．01％苯酚染毒剂量下各基因型细胞的CYP2E1酶活力出现明显差异,其中野生基因型细胞的CYP2E1酶活力显著高于突变型、杂合型基因型细胞(P<0．05)。各基因型细胞经一定浓度苯酚染毒后可出现DNA损伤效应,与对照相比,细胞的拖尾率、尾DNA含量及尾长显著升高(P<0．05),且染毒48 h、72 h时,野生基因型细胞的DNA损伤效应与突变型、杂合型细胞相比更为明显(P<0．05)。苯酚诱导后细胞的DNA损伤与CYP2E1酶活性之间呈现明显正相关性。[结论]CYP2E1 Ras I不同基因型明显影响苯酚对人淋巴细胞CYP2E1酶的诱导活性和DNA的损伤程度,其中CYP2E1 Ras I野生基因型细胞的作用最为明显。