高粱抗虫基因CYP71E1表达载体的Gateway技术构建

[目的】探讨高梁HCN途径关键酶CYP71EI基因对玉米幼苗抗螟虫的影响，为培育抗玉米螟新品种奠定基础。[方法】以高梁自交系BTx623幼苗总RNA为模板，反转录成cDNA，利用聚合酶链式反应（PCR）扩增出1854bp的CYP71E1基因全长。利用基于位点特异性重组的Gateway技术，通过TOPO克隆将该基因克隆到入门克隆（vCRw8／GW／TOP00），在LR克隆酶作用下将入门克隆重组到表达载体（pMDC141）中。【结果】成功构建pMDC141-CYP71E1表达载体并将构建好的表达载体导人农杆菌EHA105，PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。【结论】Gateway克隆技术与传统的克隆方法相比具有阳性克隆率高、快速、灵活等优点。