青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3′端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾(顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花)和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,Gen Bank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框(ORF),编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系(R=0.96,P<0.05),CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。

CYP79F1基因对西兰花的遗传转化的研究

建立有效的遗传转化体系是基因工程手段改良植物性状的重要前提。本研究对西兰花遗传转化体系进行了初步研究，成功地建立了农杆菌介导的西兰花遗传转化体系。以7日龄无菌苗的下胚轴为外植体，预培养2—3d后进行农杆菌的侵染，共培养后将外植体转移至无筛选压力的脱菌培养基中，暗培养7d后置于含有10mg·L-1卡那霉素的筛选培养基中继续培养，待不定芽生长至2—3cm时转入0．1mg·L-1IBA的生根培养基中诱导不定根，最后进行驯化和移栽，PCR分子鉴定及外源基因表达水平检测结果证明，我们已经成功地将芥子油苷合成关键酶基因CYP79F1基因转入西兰花商业品种“青秀”中，利用HPLC检测转基因植株中短链脂肪族芥子油苷的含量显著增加。