Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因在肾癌中的表达

目的探讨肾癌组织CCN蛋白中Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1基因的蛋白表达水平及意义。方法采用Western blot半定量方法检测31例肾癌组织和18例癌旁正常肾组织中Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1基因的蛋白表达。结果Cyr61、CTGF、NOV、WISP-1蛋白在肾癌组织中的表达水平均低于癌旁正常组织(P<0.05),其中乳头状肾癌的NOV和WISP-1表达水平高于透明细胞癌(P<0.05),G1级肿瘤NOV表达水平高于G2,3肿瘤(P<0.05)。结论Cyr61、CTGF、NOV和WISP-1在肾癌中低表达,CCN基因在肾癌的发生和发展中可能起抑制作用。

Cyr61和VEGF在肝细胞癌及癌周肝硬化组织中的表达及相关性分析

目的分析高半胱氨酸蛋白16(Cyr61)和血管内皮生长因子(VEGF)在肝细胞癌、癌周肝硬化组织中的表达及相关性,探讨其在肝癌发生过程中的作用。方法采用免疫组化S-P法检测58例原发性肝细胞肝癌(HCC)及癌周肝硬化组织中Cyr61和VEGF蛋白的表达,并与其临床病理特征比较分析。结果Cyr61、VEGF在癌周肝硬化组织中的表达均高于HCC,差异有统计学意义(P<0.01);Cyr61、VEGF蛋白的表达均与肿瘤的转移密切相关(P<0.05);相关性检验提示Cyr61、VEGF在HCC组织、癌周肝硬化组织中呈正相关(r=0.444,P<0.01)。结论Cyr61、VEGF异常表达与肝硬化肝癌的发展密切相关,可能在肝硬化向肝癌转化和肿瘤血管生成过程中发挥重要的作用,为肝癌的早期诊断提供了较为客观的参考指标。

肺癌组织中Cyr61基因表达及临床意义

目的:研究人肺癌组织中Cyr61基因表达的临床意义。方法:采用实时荧光定量-PCR技术和免疫组织化学染色法对60名肺癌患者的肺癌组织和癌旁肺组织的Cyr61 mRNA和蛋白表达水平进行测量。结果:80%(48/60)肺癌患者的癌组织中Cyr61表达水平低于其配对的癌旁肺组织中的水平,与免疫组织化学染色法测定的结果相一致。统计分析显示,两组间差异有统计学意义(2.742±4.165vs4.933±3.349,t=-5.112,P=0.000)。肿瘤恶性程度分级、淋巴结转移、病理学类型、吸烟状况及家族史等临床参数均可影响癌组织中的Cyr61的表达水平(P<0.05)。结论:Cyr61对肺癌的进展起重要作用,因此Cyr61表达的蛋白产物可作为临床诊断的重要指标。

Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞表达细胞外基质成分的影响

目的观察Cyr61基因过表达对人肾小管上皮细胞(HKC)表达细胞外基质成分的影响,探讨Cyr61在常染色体显性多囊肾病(ADPKD)发病中的作用及机制。方法RT PCR扩增Cyr61全长基因,构建pcDNA3.1+Cyr61重组质粒,转染HKC细胞。经RT PCR、Westernblot鉴定转染细胞系Cyr61基因的整合及表达。荧光定量PCR检测空白HKC、空质粒pcDNA3.1转染的HKC、Cyr61转染的HKC和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61、I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白的基因表达。结果构建了pcDNA3.1+Cyr61重组质粒并转染HKC细胞。Cyr61基因转染组和囊肿衬里上皮细胞内Cyr61蛋白表达显著高于空白HKC组,Cyr61基因转染组的I型和Ⅳ型胶原、层黏连蛋白mRNA表达都明显增高,且Ⅳ型胶原的基因表达增高程度远大于Ⅰ型(P<0.01)。但Cyr61基因转染组上述细胞外基质成分的表达仍显著低于囊肿衬里上皮细胞(P<0.01)。结论过表达Cyr61的HKC表达细胞外基质成分明显增强,尤以Ⅳ型胶原为著。过表达的Cyr61可能通过调节细胞外基质成分,促进细胞外基质重构,参与ADPKD囊肿的形成和发展。

即刻早期基因Cyr61在宫颈癌中的表达及与高危型HPV感染的关系

目的探讨即刻早期基因Cyr61在宫颈癌中的表达及与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系.方法收集183例宫颈病变患者,根据术后病理检查结果分为良性病变组、宫颈上皮内瘤变组、宫颈癌组,留存宫颈病变组织,免疫组化检测Cyr61表达水平,并分析Cyr61阳性率与患者病理特征的关系.采用RT-PCR及Western blot法检测人宫颈癌细胞株C33a、Caski mRNA和蛋白表达,并使用HPV16 E6特异性抑制序列siRNA转染Caski细胞株72 h,检测Cyr61 mRNA和蛋白表达.结果宫颈癌组Cyr61阳性率明显低于良性病变组和宫颈上皮内瘤变组,宫颈上皮内瘤变组Cyr61阳性率明显低于良性病变组,差异具有统计学意义(P<0.01).不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况的宫颈癌患者中Cyr61阳性率差异具有统计学意义(P<0.05),其中分化程度G 1~G 2、无宫旁浸润、有淋巴结转移的宫颈癌患者Cyr61阳性率偏高.宫颈癌细胞株C33a的Cyr61 mRNA和蛋白表达水平明显高于宫颈癌细胞株Caski,差异具有统计学意义(P<0.01).siRNA组宫颈Caski细胞中Cyr61mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05).结论Cyr61在宫颈癌组织中低表达,且与病变程度呈负相关;HPV16可能通过E6蛋白相关信号通路下调Cyr61的表达,促进宫颈癌的发生与发展.

外源性CYR61基因转染与整合素分子表达的关系

目的探讨外源性CYR61在人外周血单个核细胞(PBMC)中表达后诱导其配体——整合素表达上调的生物学特性。方法构建人源全长CYR61真核重组表达质粒pcDNA-CYR61-Fc,经DNA测序确认其序列正确后,将该质粒转染COS7细胞并用蛋白免疫印迹实验检测其蛋白的表达;用脂质体法转染人PBMC,实时定量PCR检测CYR61表达量和相关整合素的表达格局。结果测序显示所构建的CYR61重组表达质粒序列正确;将该质粒转染COS7细胞后,免疫印迹实验表明转染的细胞胞浆和营养液上清中都含有CYR61-Fc融合蛋白;将该质粒转染人PBMC,经植物凝集素刺激后,外源性CYR61迅速表达,24 h后表达量达到高峰,然后迅速下降,48 h后基本回落,整合素分子αv、αM、β3及β5表达明显上调(P<0.05),以β5最为显著(P<0.01)。结论成功构建的pcDNA-CYR61-Fc真核表达质粒能有效地表达和分泌CYR61-Fc融合蛋白;表达的融合蛋白通过自分泌或旁分泌途径上调PBMC整合素分子的表达。

Cyr61真核表达载体构建及在人原代培养软骨细胞中的表达研究

目的通过体外原代培养获得人软骨细胞,将重组真核表达载体pcDNA3.1-cyr61转染人软骨细胞,探讨外源性cyr61在软骨细胞中的表达效应。方法应用机械分离联合胶原酶消化法,原代培养获得人软骨细胞,镜下观察及扫描电镜分析软骨细胞形态,Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)免疫细胞化学及甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞表型;构建pcDNA3.1-cyr61真核表达载体,Fugene介导转染人软骨细胞,Western blot验证其表达效应;RT-PCR检测重组质粒转染后软骨细胞CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因mRNA表达改变。结果Ⅱ型胶原免疫细胞化学、甲苯胺蓝染色及形态学分析证实原代培养获得的细胞为人软骨细胞;酶切与DNA测序显示pcDNA3.1-cyr61重组质粒成功构建,Western blot检测表明外源性cyr61重组质粒能有效表达于人原代软骨细胞,且目的蛋白cyr61表达水平较空白组细胞明显升高;cyr61重组质粒转染软骨细胞后其CollagenⅡ、AggrecanmRNA表达呈明显增高。结论 Cyr61蛋白在人原代培养软骨细胞中呈表达缺失,外源性cyr61基因能有效表达于人软骨细胞,并且能增加软骨细胞CollagenⅡ、Aggrecan基因的mRNA表达,为进一步利用cyr61基因修饰软骨细胞增强其生物学功能奠定基础。

大恒肉鸡CYR61基因在不同组织中的表达差异研究

为研究CYR61基因对鸡肌肉生长发育的影响,试验利用定量PCR方法对CYR61基因在大恒肉鸡不同组织、不同生长发育阶段的表达差异进行对比分析,并绘制1～10周龄的体重曲线和周龄增重曲线。结果表明：2,6,10周龄CYR61基因在腿肌、胸肌和肝脏组织均有表达,其中胸肌组织2,10周龄的表达量极显著高于腿肌组织（P 〈0. 01）,腿肌组织6周龄的表达量显著高于胸肌组织（P 〈0. 05）;胸肌组织与腿肌组织具有相似的基因表达模式,其中胸肌组织6周龄表达量极显著高于10周龄（P〈0. 01）,显著高于2周龄（P〈0. 05）,腿肌组织6周龄表达量极显著高于10周龄和2周龄（P〈0. 01）。说明CYR61基因在孵化后肉鸡生长发育过程中有重要的调控作用。

Cyr61基因siRNA表达载体的构建及沉默作用研究

目的:构建Cyr61靶向siRNA重组表达载体,为探讨抑制Cyr61基因表达对机械通气所致肺损伤的研究奠定基础。方法:根据GenBank数据库提供的Cyr61基因核苷酸序列,选择设计3条能转录siRNA的DNA序列,命名Cyr61-1 siRNA,Cyr61-2 siRNA,Cyr61-3 siRNA,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照。据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil1.1载体,转化扩增后进行序列测定。4种重组表达载体转染肺癌A549细胞,逆转录RT-PCR和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测Cyr61的表达。结果:经酶切鉴定和测序结果证实Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功,它对大肠癌细胞Cyr61 mRNA和蛋白的表达抑制率分别为60.54%和52.97%。结论:Cyr61靶向siRNA重组表达载体构建成功并能显著抑制Cyr61基因的表达。

Cyr61的生物学作用及其调控机制

富半胱氨酸61(Cyr61)作为CNN家族重要成员,是一种细胞外基质分子或细胞外信号分子,参与了细胞内、外信号的转导,影响细胞的生长、分化、黏附和运动,具有广泛的生物学特性。Cyr61蛋白由4个结构域构成,可以和不同的信号因子结合,扮演着十分吸引人的"兼职蛋白"的角色,在不同的生理、病理条件下拥有多重生物学功能。目前国内外对其功能和机制的研究已经成为热点。多项研究发现Cyr61差异性表达可能影响机体正常生理、病理及癌变等过程的发生发展。本文将对Cyr61在生物体内参与的表达调控、信号转导机制的最新研究作一综述。

鲤CYR61基因的克隆、表达及系统进化树的构建

通过鲤(Cyprinus carpio)基因组序列与斑马鱼(Danio rerio)CYR61基因编码区全序列的比对得到了CYR61 A、CYR61 B和CYR61 C共3条序列。分别克隆、测序得到其开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)分别是1 158 bp、1 053 bp、1 107 bp,CYR61 A和CYR61 C得到完整编码区,都是由5个外显子和4个内含子构成,分别编码385、368个氨基酸,其理论等电点值分别是7.83、8.54,分子量(Mw值)分别为42.55 ku、40.83 ku。鲤3个CYR61基因具有高度同源性,并且均含IB、vWC、TSP1、CT 4个模块。分子系统学分析表明鲤CYR61基因与其他物种CYR61基因具有高度同源性,且CYR61 C与其他高等物种的CYR61同源性更高,利用MEGA 5.0计算出CYR61 A、CYR61 B和CYR61 C的分化时间早于鲤和斑马鱼的物种分化。CYR61 C在13个组织中均有表达,在卵巢中表达最高,肠、脑、鳃次之,在其他组织中表达较低且在心脏中表达最低。CYR61 A在精巢、肠、鳃中表达较高。CYR61 B在精巢和脑中表达最高,肠、肌肉、卵巢次之。实时荧光定量PCR分析CYR61 3个复制在鲤胚胎发育时期的表达,都是在0 h相对表达量最高,显著降低至18 h或24 h,随后逐渐升高并在6 d时下降。

基于CRISPR/Cas9技术构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株及其生物学功能检测

为了探讨Cyr61的生物学功能,该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cyr61敲低的HEK293T稳定细胞株,并在体外研究Cyr61对HEK293T细胞增殖和凋亡的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,应用http://crispr.mit.edu/在线设计3条Cyr61的导向RNA(guide RNA,gRNA),用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-gRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,经筛选后包装成Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒,利用Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒转染HEK293T细胞,加入嘌呤霉素(8μg/mL)进行筛选,通过实时荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定出HEK293T敲低Cyr61细胞株;常规培养细胞,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。该研究成功构建出Cyr61敲低HEK293T细胞株,与对照组相比,Cyr61敲低细胞株的增殖明显升高(P<0.05),凋亡率明显减少(P<0.05)。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株,为研究Cyr61基因提供了有效的工具。