尼莫地平对癫痫大鼠海马Ca^(2+)浓度及Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ_α表达的影响

目的探讨尼莫地平(nimodipin,NIM)对戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)点燃癫痫大鼠空间学习记忆能力及海马细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡα,CaMKⅡα)蛋白表达的影响。方法将动物分为正常对照组、PTZ组和NIM+PTZ组,采用PTZ慢性点燃癫痫模型,应用Mor-ris水迷宫观察各组大鼠空间学习记忆能力,运用流式细胞仪检测海马细胞内[Ca2+]i变化,Western blot方法测定CaMKⅡα蛋白的表达。结果PTZ组大鼠空间学习记忆能力受损,其海马细胞内[Ca2+]i明显升高(P<0.05),CaMKⅡα蛋白水平较正常对照组减少(P<0.05);与PTZ组比较,NIM+PTZ组大鼠空间学习记忆能力好转,其海马细胞内[Ca2+]i下降(P<0.05),CaMKⅡα蛋白水平升高(P<0.05)。结论PTZ点燃癫痫大鼠海马存在钙超载及CaMKⅡα的表达异常,由此引起大鼠空间学习记忆能力受损;NIM可以降低细胞内[Ca2+]i,提高CaMKⅡα的表达,改善癫痫大鼠的学习记忆能力。

慢性染铅对小鼠海马Ca^(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的通过检测海马Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)基因表达来探讨慢性铅中毒影响学习记忆的分子机制。方法小鼠交配后,通过饮水饲以2.4,4.8和9.6mmol·L-1醋酸铅。小鼠子代自胚胎期始即暴露于醋酸铅。幼鼠出生后,先通过哺乳接触铅,断乳后则自行饮用与母鼠饮用浓度相同的含铅水。6周后用逆转录聚合酶链反应法观察各组小鼠海马CaMKⅡmRNA的表达。结果3个染铅组小鼠CaMKⅡmRNA水平均明显降低,并具有浓度效应关系。结论铅致CaMKⅡ基因表达水平下降。

皮质酮对原代培养的海马神经元及其[Ca^(2+)]_i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的:探讨皮质酮(CORT)对培养的海马神经元及其[Ca2+]i和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响和可能的机制。方法:海马神经元被分为不同终浓度的CORT处理组、CORT+MK-8 0 1或高浓度葡萄糖组。采用MTT法、流式细胞术、荧光标记和免疫细胞化学法,观察海马神经元活力、死亡方式[、Ca2+]i和CaMKⅡ表达的变化规律。结果:1 0-6和1 0-5mol/L CORT组,其海马神经元的活力明显降低,分别以凋亡和坏死为主,并使海马神经元[Ca2+]i显著升高;CaMKⅡ的表达明显减少。MK-8 0 1和高浓度葡萄糖均能拮抗1 0-6mol/L CORT对海马神经元的损伤作用。结论:在CORT的作用下,海马神经元发生凋亡和坏死;[Ca2+]i升高可能既是海马神经元损伤的结果,又是引起其发生凋亡和CaMKⅡ表达下降的原因。

Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在PDGF诱导肝星状细胞胶原合成中的作用

目的观察Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)对PDGF诱导下人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)colla-genα1(Ⅰ)合成的影响。方法 CaMKⅡαsiRNA转染对HSC内CaMKⅡα进行干扰,real-time PCR法检测HSC collagenα1(Ⅰ)及TIMP-1 mRNA的表达,Western blot法检测collagenα1(Ⅰ)及MMP-2、TIMP-1表达的变化,ELISA法检测HSC collagenα1(Ⅰ)分泌的变化。结果 CaMKⅡαsiRNA可显著抑制PDGF诱导下HSC collagenα1(Ⅰ)及MMP-2、TIMP-1的转录、蛋白表达以及collagenα1(Ⅰ)的分泌,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 CaMKⅡα信号参与了PDGF诱导下HSC collagenα1(Ⅰ)的产生与分泌,同时通过抑制MMP-2、促进TIMP-1的表达而阻止胶原的降解,是肝纤维化发展过程中PDGF信号的重要调控分子和肝纤维化的潜在治疗靶点。

蛋白磷酸酶1与Ca^(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究进展

蛋白质的磷酸化与去磷酸化是细胞信号转导过程中最重要的调控方式,其循环过程就像调控分子的开关一样,参与众多生理活动。负责这一修饰调节的是蛋白激酶与蛋白磷酸酶。报道显示人类染色体编码多达500个蛋白激酶,这些蛋白激酶满足人类高度多样性与差异性调控蛋白磷酸化作用,而有趣的是人类编码的蛋白磷酸酶却仅仅约为150个,其中约有40个是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。越来越多的证据表明蛋白磷酸酶/蛋白激酶调控异常在心肌病中起关键作用。蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)是一多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,研究显示PP1在心肌肥厚和心衰的发生发展过程中起重要作用。而Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它作为Ca2+信号转导的关键因子,调节细胞的多种生物学功能,其功能异常可引起肥厚心肌胞内钙稳态失衡进而引起心律失常等心肌病。该文就PP1与CaMKⅡ的功能和心肌病的关系作一综述。

Ca^(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心脏重构中作用的研究进展

Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ是一种分布广泛的多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与调节心脏的多种生理活动,如兴奋-收缩耦联和兴奋-转录耦联等生理过程;然而钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的持续过度表达会催化激活多种心脏靶蛋白,包括离子通道、Ca2+稳态蛋白、转录因子等,引起兴奋-收缩耦联、兴奋-转录耦联缺陷,提示钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ信号通路是促进心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的中心机制之一。现对近几年来这一领域的进展进行扼要综述。

钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ和兰尼碱受体2与内质网钙渗漏关系的研究进展

内质网是人体Ca2＋中转站,是钙循环的重要调节中心.内质网通过调节心肌细胞内游离Ca2＋的浓度来控制心肌的收缩和舒张.心肌细胞膜上L型Ca2＋通道开放,形成内向Ca2＋流激活肌浆网Ca2＋释放通道,使得大量Ca2＋进入细胞质.当细胞质内游离Ca2浓度达10-5mmol/L时,肌钙蛋白被激活,使肌球蛋白和肌动蛋白相互接触,引起心肌收缩.心肌收缩后内质网钙泵又将细胞内游离Ca2＋重新泵回内质网中储存.当细胞质内游离Ca2＋浓度降低至10-7mmol/L时,肌球蛋白和肌动蛋白分离,引起心肌舒张,这样就形成一个完整的心脏收缩-舒张过程.任何原因导致的内质网Ca2＋渗漏,都会引起Ca2＋调节异常,使得心肌细胞收缩、舒张功能障碍,最终引起心力衰竭和心律失常等疾病的发生.钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是细胞内Ca2＋的关键调节分子,兰尼碱受体2（RyR2）是内质网Ca2＋释放的重要通道,本文对CaMKⅡ-RyR2和内质网钙渗漏的关系进行综述.

血管性痴呆大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸-2B亚基受体水平和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ活性以及美金刚干预作用的研究

目的研究血管性痴呆(VD)大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸-2B亚基受体(NR2B)水平和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活性的变化以及美金刚的干预作用。方法采用结扎双侧颈总动脉方法制备VD大鼠模型,随机分为VD模型组(VD组)和美金刚治疗组(美金刚组)。于术后4周、8周、12周、16周用Morris水迷宫试验检测VD组和美金刚组大鼠的学习记忆水平,用RT-PCR法检测大鼠海马NR2B水平,用32P掺入法检测大鼠海马CaMKⅡ的活性;并与假手术组比较。结果与假手术组比较,VD组大鼠术后各时间点的学习记忆能力均显著下降(均P<0.01);海马NR2B的水平术后4周时明显增高(P<0.05),术后8～16周显著降低(均P<0.01);海马总CaMKⅡ活性术后4周时明显增高(P<0.01),术后8周下降,术后12周、16周明显降低(均P<0.01)。美金刚组术后4周时上述3项检测结果与VD组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01),而与假手术组比较,差异均无统计学意义;在其他时间点,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05～0.01);学习记忆水平和NR2B水平术后8周、12周明显高于VD组(P<0.01～0.05);总CaMKⅡ活性与VD组比较,差异无统计学意义。结论VD大鼠海马NR2B水平和总CaMKⅡ活性降低;美金刚能上调海马NR2B表达及改善VD大鼠的认知功能,但对CaMKⅡ活性的影响有限。

水稻叶片Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶的纯化和活性测定

通过高速离心、( NH4) 2 SO4沉淀、琼脂糖凝胶过滤和 Ca M- sepharose4B亲和层析 ,从 HPGMR( 5 8S)叶片中初步纯化出 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶 .纯化的 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶线性梯度电泳 ,亚基分子量约为 5 5× 10 3.在 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的标准反应体系中 ,存在过量的 ATP,提取磷酸化反应剩余的 ATP,用叶绿体 Mg2 + - ATP酶分解 ATP,最后用复合孔雀绿测定无机磷 ,从而来计算 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的活性 .实验结果表明 ,该酶活性是依赖 Ca2 + 和 Ca M的 ,并且 EGTA和

石杉碱甲对血管性痴呆小鼠海马神经细胞[Ca^(2+)]_i及钙调蛋白、蛋白激酶Ⅱ信使核糖核酸表达的影响

目的 :观察石杉碱甲对血管性痴呆 (VD)小鼠海马神经细胞 [Ca2 + ] i 和钙调蛋白 (CaM) ,Ca2 +钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMPKⅡ )mRNA表达的影响。方法 :采用双侧颈总动脉线结法 ,制作小鼠VD模型 ,并设假手术对照组 ,石杉碱甲为治疗组 ;术后d 2 9,30测试学习、记忆成绩。利用激光共焦显微镜检测各组海马神经细胞 [Ca2 + ] i;用RT PCR技术检测CaM ,CaMPKⅡmRNA。结果 :模型组[Ca2 + ] i 荧光强度 (44±s 3)显著高于假手术组(2 6± 4) (P <0 .0 1 )和石杉碱甲组 (2 8.5± 2 .5) (P<0 .0 1 ) ;模型组CaMmRNA含量 (0 .76± 0 .2 1 )显著低于假手术组 (1 .1 3± 0 .2 3) (P <0 .0 1 )和石杉碱甲组 (0 .97± 0 .1 9) (P <0 .0 5) ,CaMPKⅡmRNA含量(0 .43± 0 .0 7)显著低于假手术组 (0 .67± 0 .1 0 )(P <0 .0 1 )和石杉碱甲 (0 .61± 0 .0 8) (P <0 .0 1 )。结论 :石杉碱甲可降低VD小鼠海马神经细胞[Ca2 + ] i,提高CaM ,CaMPKⅡmRNA表达水平 。

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶抑制VEGFR2介导的人胃癌HGC-27细胞增殖

目的:探讨Ⅱ型c GMP依赖性蛋白激酶(typeⅡc GMP-dependent protein kinase,PKGⅡ)对血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)介导的人胃癌HGC-27细胞增殖的影响及其作用机制。方法:应用编码PKGⅡc DNA的腺病毒(Ad-PKGⅡ)感染HGC-27细胞,使其高表达PKGⅡ,并以特异性激动剂8-p CPTc GMP激活PKGⅡ。应用血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)激活VEGFR2。MTT法检测细胞增殖;蛋白质印迹法检测p-VEGFR2、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-protein kinase B,p-PKB/p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK1/2)表达;免疫共沉淀法检测PKGⅡ与VEGFR2的结合;免疫沉淀法联合蛋白质印迹法检测PKGⅡ对VEGFR2丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine,Ser/Thr)的磷酸化作用。结果:VEGF-A可促进HGC-27细胞增殖,并诱导胞内p-VEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平明显升高;以Ad-PKGⅡ感染HGC-27细胞使其高表达PKGⅡ并激活后,VEGF-A引起的细胞增殖受到明显抑制,pVEGFR2、p-Akt和p-ERK1/2表达水平显著降低;PKGⅡ可与VEGFR2相互作用,使后者丝氨酸/苏氨酸磷酸化。结论:激活的PKGⅡ可通过使VEGFR2发生丝氨酸/苏氨酸磷酸化抑制人胃癌HGC-27细胞的VEGFR2酪氨酸磷酸化,进而抑制其下游的增殖相关信号转导,最终抑制该细胞的增殖。

诱导性低温复苏对失血性休克大鼠肠组织Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅰ表达影响

目的探讨诱导性低温复苏对失血性休克大鼠肠组织Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅰ(CaMKⅠ)表达的影响。方法选取成年雄性Wistar大鼠30只,随机分为假手术组(n=6)、常温复苏组(n=12)以及低温复苏组(n=12)。假手术组仅进行外科插管及相关手术操作,不建立失血性休克模型;常温复苏组及低温复苏组每只大鼠放血25 ml/kg,构建失血性休克模型,休克60 min后分别采取38℃和32℃复苏并维持60 min,复苏结束后将大鼠体温恢复至38℃并监测血流动力学3 h。大鼠复苏3 h后,3组均随机选取50%的大鼠处死,取小肠黏膜、肠系膜淋巴结及血液,剩余大鼠进行72 h生存分析。采用定量聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质印迹法分别检测3组大鼠肠黏膜中CaMKⅠmRNA及蛋白表达情况,应用酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠血清炎性因子表达情况,同时,进行细菌移位检测。结果复苏3 h后,低温复苏组大鼠的心率和平均动脉压(MAP)均低于常温复苏组,而心输出量、每搏量和射血分数均高于常温复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。设定72 h为观察终点,假手术组大鼠于观察终点时全部存活,低温复苏组大鼠的生存时间为(63.50±9.59)h,明显长于常温复苏组的(46.83±19.59)h,差异有统计学意义(P<0.05)。在液体复苏3 h后,低温复苏组CaMKⅠmRNA表达水平、灰度值均明显低于常温复苏组,差异有统计学意义(P<0.05);常温复苏组与低温复苏组CaMKⅠmRNA、蛋白表达水平均明显高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组大鼠血清中CaMKⅠ、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8水平明显低于常温复苏组和低温复苏组,IL-10水平高于常温复苏组,但低于低温复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。低温复苏组大鼠血清中CaMKⅠ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平明显低于常温复苏组,IL-10水平明显高于常温复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。复苏3 h后,低温复苏组大鼠血液细菌移位量、肠系膜淋巴结细菌移位量均明显低于常温复苏组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在诱导性低温复苏条件下,失血性休克大鼠肠组织中CaMKⅠmRNA及蛋白水平表达降低,大鼠生存时间延长,CaMKⅠ下调可能是诱导性低温复苏减轻大鼠失血性休克肠缺血再灌注损伤的重要分子机制。

结直肠癌中钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ的表达及其意义

目的分析钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ体内外的表达情况并探讨其机制,为临床诊断治疗提供新的靶点。方法采用半定量RT-PCR技术检测3种人结直肠癌细胞系、20对结直肠癌组织及其配对癌旁组织中CAMKⅡδmRNA的表达水平;利用Western Blot技术及免疫组化SP技术检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中CAMKⅡδ蛋白的表达情况,并结合患者的临床病理参数进行分析。结果CAMKⅡδmRNA水平在3种结直肠癌细胞系中均有较高的表达,其中SW620表达最高,依次为HT-29、RKO。20对结直肠癌组织,有16对癌组织中CAMKⅡδmRNNA表达高于癌旁组织,其值分别是0.48±0.31和0.25±0.16,两者之间有统计学差异(P=0.002)。1 Western Blot的检测结果与RT-PCR的检测结果相一致,同样可以观察到CAMKⅡδ在配对的癌组织中的表达强于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化提示CAMKⅡδ在结直肠癌组织中免疫反应强阳性,而癌旁正常组织中表达明显减弱。20例结直肠癌组织标本中,CAMKⅡδ的阳性表达率为55%(11/20),明显高于癌旁正常组织的表达率20%(4/20)。(P=0.022)结论 CAMKⅡδ在结直肠癌细胞系及结直肠癌组织中高表达,提示可能促进肿瘤细胞的不断增殖,与直肠癌的发生发展密切相关。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在心律失常中作用的研究进展

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ已成为许多心脏疾病特别是心律失常的关键酶,尽管近年来已经阐明了导致钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ激活的许多途径,但几乎没有任何影响钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ活性的临床上可行的化合物从基础体外研究发展到体内研究。现重点介绍抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的抗心律失常策略的最新进展。并将详细论述钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂在心房颤动、遗传综合征、窦房结功能障碍中的抗心律失常作用及具有潜在临床应用的新型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂。

钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在窦房结中的生物学作用

Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ表达在窦房结细胞中,能够在不影响基础心率的条件下调节应激时的心率反应,通过作用于窦房结细胞上的离子通道及细胞内的钙通道、受磷蛋白和雷诺定受体等信号蛋白调节窦房结起搏功能,还能感应钙超负荷、氧化应激和高血糖状态,影响窦房结功能障碍发展进程。现简要总结钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在窦房结中的生物学作用。

糖尿病大鼠脑细胞周期依赖性蛋白激酶5和蛋白激酶A参与调节Tau蛋白磷酸化

细胞周期依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5,Cdk-5)及蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)是调节Tau蛋白磷酸化的重要激酶,其对糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠脑内Tau蛋白磷酸化的作用如何,目前尚不明确.为探讨胰岛素缺乏的DM大鼠海马Cdk-5及PKA对Tau蛋白磷酸化的作用,用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立DM大鼠模型,Fura-2负载及荧光测定细胞内游离Ca2+浓度,免疫沉淀法测定Cdk-5活性,放射性配体结合实验检测PKA的活性,蛋白质印迹检测Tau蛋白磷酸化的水平.结果提示:在DM大鼠海马神经元,Ca2+浓度升高,Cdk-5及PKA活性升高,Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202和Ser396/Ser404位点的磷酸化增强.Cdk-5的特异性抑制剂roscovitine可降低DM大鼠Cdk-5活性,但不能降低PKA活性,使Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点磷酸化水平降低,但不降低Ser396/Ser404位点的磷酸化,roscovitine处理正常大鼠后,上述酶的活性及Tau蛋白的磷酸化无明显变化.首次从整体水平上证实DM大鼠海马Cdk-5及PKA活性升高,协同促进Tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202位点和Ser396/Ser404位点的磷酸化,神经元内游离Ca2+浓度升高可能起重要作用.

血管性痴呆小鼠海马神经细胞静息态[Ca^(2+)]_i及CaMmRNA、CaMPKⅡmRNA表达的变化

目的 :观察血管性痴呆小鼠海马神经细胞内静息态游离Ca2 + 浓度 ([Ca2 + ]i)和钙调素 (CaM)、CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMPKⅡ )mRNA表达水平的变化 ,探讨上述因素在血管性痴呆发病中的作用。方法 :采用双侧颈总动脉线结、缺血 /再灌注的方法 ,制备小鼠血管性痴呆模型 ,并设假手术组作为对照。分别于术后第 2 9d、第 30d进行学习、记忆成绩测试 ,然后快速取海马制备海马活细胞 ,以Fluo 3/AM为荧光探针 ,在激光扫描共聚焦显微镜下观察两组海马神经细胞静息态 [Ca2 + ]i 变化 ,并应用RT PCR技术检测海马神经细胞内CaMmRNA、CaMPKⅡmRNA的表达水平。结果 :①模型组的学习和记忆成绩均低于假手术组 (P <0 .0 5 ) ;②模型组神经细胞静息态 [Ca2 + ]i 显著高于假手术组 (P <0 .0 5 ) ;而CaMmRNA、CaMPKⅡmRNA表达水平低于假手术组 ,具有极其显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 :海马神经细胞静息态 [Ca2 + ]i增高、CaMmRNA和CaMPKⅡmRNA表达减少是导致小鼠血管性痴呆发生的机制之一。