荧光团杂化纳米SiO_2微球作为生物标记探针的应用研究

Recent advances in the nanomaterials, such as luminescent quantum dots, latex fluorescent nanospheres and dye-doped silica nanoparticles, have opened a promising field toward the development of luminescent biolabel. In this paper, we develop a kind of novel nanometer-sized fluorescent hybrid silica(NFHS) particles used as a sensitive and photostable fluorescent probe in biological staining and diagnostics. The NFHS particles are prepared by controlled hydrolysis of the fluorophore silica precursor using the reverse micelle technique. The fluorophores are dispersed homogeneously in the silica network of the NFHS particles and well protected from the environmental oxygen. In comparison with single organic fluorophores without incorporation, these nanoparticle probes are brighter, more stable against photobleaching and do not suffer from intermittent on/off light emission(blinking). The NFHS particles have also shown unique advantages over the existing common organic fluorophores, quantum dots, and latex-based fluorescent particles for biomolecule recognition in the following four major points: easy preparation, good photostability, high sensitivity, and low toxicity. The approach proposed in this article for making NFHS nanoparticles is a general one, and it is not restricted to a particular type of fluorophore molecule as selected in this study.

5(6)-羧基荧光素标记2′-脱氧尿苷的合成

以5-碘-2'-脱氧尿嘧啶为起始原料,5(6)-羧基荧光素为荧光标记物,经6步反应合成了5(6)-羧基荧光素标记的2′-脱氧尿苷,并利用高效液相色谱(HPLC),1HNMR和13CNMR对目标化合物的纯度和结构进行了表征.

拟南芥Ran2小GTP结合蛋白抗血清的制备及其FITC荧光标记

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。

冷藏凡纳滨对虾肌肉软化的生化特性及生物标记物

【目的】探究冷藏凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)质构品质劣变生化变化特性并识别生物标记物。【方法】测定凡纳滨对虾4℃冷藏期间肌肉质构参数,检测肌肉组织中糖原与乳酸含量、ATP水平,以及Ca^(2+)-ATP酶、酸性与碱性磷酸酶(ACP、AKP)活性,分析无氧代谢特征和磷酸化调控酶活性动态变化,解析各指标间相互联系。【结果与结论】4℃冷藏期间对虾质构指标迅速下降,冷藏72 h后硬度显著下降至(2947±113)g(P<0.05),肌原纤维小片化指数(MFI)与质构指标呈显著负相关(P<0.01);新鲜对虾冷藏24 h后磷酸果糖激酶(PFK)活性显著下降至(20.82±0.38)U/mg(P<0.05),且PFK活性与糖酵解各指标相关性最强,其调控的糖酵解是触发和加速肌肉快速软化的关键前期生化事件;ATP含量调控磷酸酶和Ca^(2+)-ATP酶活性,ACP活性和AKP活性在冷藏96 h显著上升至(16.39±1.17)U/mg和(0.86±0.05)U/mg(P<0.05),Ca^(2+)-ATP酶活性24 h后降至(0.50±0.01)U/mg(P<0.05)。随时间延长,Ca^(2+)-ATP酶活性下降诱导内质网释放Ca^(2+)诱导磷酸酶开启去磷酸化进程,蛋白质降解信号暴露被泛素化标记,肌原纤维蛋白进而被降解;相关性分析结合生化基本原理初步判定,Ca^(2+)-ATP酶为质构劣化的生物标记物。

中药脊髓Ⅰ号对脊髓厚片Ca^(2+)荧光强度的影响

目的 探讨中药脊髓Ⅰ号对脊髓厚片Ca2 + 荧光强度的影响。方法 将 33只Wistar大鼠随机分为 3组 :下胸段脊髓半横断组 (损伤组 )、对照组和中药脊髓Ⅰ号治疗组。快速处死大鼠 ,取下胸段脊髓 ,切脊髓厚片 ,用Fluo 3荧光染料孵育 ,激光共聚焦显微镜观察。结果 损伤组、对照组和中药治疗组左侧Ca2 + 荧光强度分别为 12 6 3± 3 2 7、13 34± 3 5 1和 12 89±3 31,右侧分别为 2 1 6 8± 3 6 9、14 72± 2 12和 12 97± 3 6 0 ,损伤组脊髓厚片损伤侧Ca2 + 荧光强度显著升高 ,治疗组两侧灰质Ca2 + 荧光强度无显著差异。结论 (1)损伤侧Ca2 + 荧光强度显著升高 ;(2 )中药脊髓Ⅰ号对Ca2 + 荧光强度的升高有一定抑制作用。

Ca^(2+) Mg^(2+)对柔红霉素结合心肌肌球蛋白影响的荧光法研究

利用荧光光谱法研究了生理pH下,Ca2+、Mg2+对柔红霉素(Daunorubicin,DNR)与心肌肌球蛋白(car-diac myosin,CM)结合作用的影响。求得20℃,cCa2+=2.0×10-3mol/L,cMg2+=1.2×10-3mol/L时,Ca2+-DNR-CM、Mg2+-DNR-CM和Ca2++Mg2+-DNR-CM的猝灭常数和结合常数分别为:1.280×105L/mol、1.469×105L/mol和2.237×105L/mol和1.165×105L/mol、1.274×106L/mol和1.848×103L/mol。结果表明:Ca2+、Mg2+对DNR-CM均有荧光猝灭作用,且混合离子能竞争性抑制DNR与CM的结合,而异常的Ca2+、Mg2+浓度增强了DNR对CM的荧光猝灭作用,导致其心脏毒性。

基于核酸适配体功能化荧光氧化石墨烯的免标记“Turn-off”型Hg2+传感器研究

利用湿化学法制备出具有一定荧光性能的氧化石墨烯(GO)负载金纳米颗粒(AuNPs)复合材料(GO@AuNPs),并将巯基化单链富T核酸适配体(aptamer)结合在该复合材料的金纳米颗粒表面,形成aptamer功能化氧化石墨烯-金纳米颗粒复合物(aptamer-GO@AuNPs)。当汞离子存在时,由于7个T-Hg^2+-T结构的配位作用,aptamer折叠形成刚性的发夹状双链DNA结构,并使Hg 2+靠近石墨烯表面(少于1 nm),使得电子可沿着双链DNA通道从石墨烯转移到汞离子,从而猝灭氧化石墨烯的荧光,由此构建了一种基于石墨烯荧光猝灭的“turn-off”型荧光传感器。考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,此方法对Hg^2+的线性检测范围为0.5~80 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。应用于环境水体样品中Hg^2+的检测,加标回收率为96.0%~105%,相对标准偏差为1.4%~3.2%。该方法操作简单,有较强的抗干扰能力,灵敏度和选择性高,不需要标记,检测快速,可用于环境水体样品中Hg^2+的高灵敏检测。

基于联萘酚衍生物的荧光传感器对Ca^(2+)的选择性测定

设计了基于联萘酚衍生物(LZ)的高选择性的荧光化学传感器,分别采用荧光光谱和紫外-可见光谱法研究了其对Ca^(2+)的识别.结果显示,与其他金属离子,如Ag^+、Al ^(3+)、Bi ^(3+)、Cd^(2+)、Co^(3+)、Cr^(3+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)、Hg^(2+)、K^+、Mg^(2+)、Mn^(2+)、Ni ^(2+)、Pb^(2+)、Zn^(2+)相比,探针LZ对Ca^(2+)呈现良好的选择性.并且该探针在486nm处的荧光强度与Ca^(2+)浓度在2~7μmol/L范围内呈现良好的线性关系,其回归系数为0.994,检测限为0.8μmol/L,多次测定的相对标准偏差为2%.

基于发光共振能量转移的无标记上转换荧光探针灵敏检测8-OHdG

8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)是一种重要的DNA损伤标志物,其含量的多少可反映人体的氧化损伤程度。本研究以氨基功能化的上转换纳米粒子(Upconversion nanoparticles,UCNPs)为能量供体,金纳米粒子(AuNPs)为能量受体,由于AuNPs可导致UCNPs在545 nm处的荧光发生猝灭,而8-OHdG能够对AuNPs产非特异性诱导团聚作用,从而改变UCNPs在该位置处的荧光强度,据此构建了一种基于发光共振能量转移(Luminescence resonance energy transfer,LRET)的上转换荧光探针,并用于尿样基质中8-OHdG的检测。所建立方法简单、灵敏且适用pH范围宽。在AuNPs溶液的浓度为1.34 nmol•L^(−1),pH为2~7的实验条件下,所构建探针能够分别在低浓度范围(1.67×10^(−11)~3.3×10^(−9)mol•L^(−1))和高浓度范围(1.0×10^(−8)~3.3×10^(−6)mol•L^(−1))内实现对8-OHdG的快速检测。共存干扰实验结果表明,尿样中常见的无机离子和化合物存在的前提下,所构建探针对8-OHdG呈现了良好的选择性。将探针应用于实际尿液样品基质中8-OHdG的检测,加标回收率为91.4%~109.2%。

细胞内游离Ca^(2+)的荧光指示剂研究进展

Ca2+在细胞的生命活动中起着重要作用,游离Ca2+浓度的变化与细胞的功能、信号传递及其损伤和凋亡都有着密切的联系,故胞内游离Ca2+浓度(简写为[Ca2+]i)的含量及其时空分布的精确测定极为重要.对目前用于测定细胞内游离Ca2+浓度的常见荧光指示剂进行了综述,分析了常用的研究方法并对其优、缺点进行了简单的比较和评述.

荧光标记DNA探针用于水溶液中Hg^2＋的检测

Hg^2＋是存在于水溶液中一种最常见、最稳定的汞污染方式。目前尽管已有大量的Hg^2＋检测方法见诸报道，但对于大多数方法而言，要么选择性差，要么设计复杂、操作困难，要么易产生假阳性信号。最近，Wang等开发了一种新型的Hg^2＋荧光传感器，该传感器可以实现Hg^2＋的高灵敏度、高特异性检测。本实验在文献基础上，提出了一种探针设计方案。研究结果表明，该探针设计方案同样可用于Hg^2＋的高特异性定量检测。

通过荧光标记的凝胶阻滞技术分析Opaque2蛋白与ZmGRAS11启动子的结合位点

凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是研究蛋白质与核酸结合的一种关键实验技术。EMSA技术兴起以来,使用放射性同位素、生物素标记核酸探针的手段已经非常成熟,但这两种传统的标记技术分别具有放射性探针稳定性差和生物素检测步骤复杂等缺点。近年来,尽管荧光标记探针逐渐被应用于EMSA中,但是对于利用荧光标记探针的EMSA仍缺乏系统的报道。对荧光标记的EMSA技术流程进行了优化和系统总结;利用6-羧基荧光素(6-carboxy-fluoroscine,FAM)标记ZmGRAS11启动子探针,通过EMSA检测其与Opaque2蛋白的结合,明确了蛋白和探针的适宜比例为8∶1。对GCN4 motif序列碱基进行突变并利用EMSA分析Opaque2与ZmGRAS11启动子之间的结合位点,结果表明GCN4 motif的“TGAC”核心基序在ZmGRAS11启动子与Opaque2蛋白的结合中可能起到了关键作用。研究结果为进一步探究Opaque2-ZmGRAS11转录调控模块在玉米籽粒发育中的作用机理提供了数据支撑。

荧光标记用Sr2MgSi2O7∶Eu(2＋),Dy(3＋)纳米发光材料的研究

通过水热共沉淀法制备了Sr_2MgSi_2O_7∶Eu^(2+),Dy^(3+)纳米发光材料并对其进行表面修饰,研究了添加不同金属络合剂对样品粒径、分散性、发光性能的影响及表面修饰后样品的性能。通过X射线衍射分析,激发发射光谱及余辉性能测试研究了不同金属络合剂对Sr_2MgSi_2O_7∶Eu^(2+),Dy^(3+)结晶性能、发光性能的影响,通过SEM和TEM图分析研究了不同金属络合剂对颗粒粒径、分散性的影响,结果表明添加EDTA时样品结晶与发光性能良好且粒径为50~200 nm,为制备Sr_2MgSi_2O_7∶Eu^(2+),Dy^(3+)纳米发光颗粒的最佳添加剂。此外,将样品进行表面修饰后,通过红外光谱、Zeta电势分析研究了其官能团的连接情况和电势大小,通过纳米粒度分析、SEM和TEM图谱分析研究了表面修饰后样品的粒径分布、形貌以及核壳结构,结果表明样品表面修饰后成功包裹了SiO_2壳层,并通过悬浮测试证明了SiO_2包覆后的长余辉纳米粒子悬浮性能良好。

基于CdTe量子点荧光探针对CS_(2)生物标记物2-硫代噻唑烷-4-羧酸的快速检测

2-硫代噻唑烷-4-羧酸(TTCA)是CS_(2)在人体内与谷胱甘肽反应形成的一种杂环化合物,通过对尿液中TTCA浓度的检测,可以评估其接触有毒化工原料CS_(2)的情况。我们以合成的碲化镉量子点(CdTe QDs)作为荧光探针,并基于TTCA对CdTe QDs的荧光猝灭效应,建立了CS_(2)生物标记物TTCA的快速定量检测新方法。在优化的实验条件下,CdTe QDs猝灭强度与TTCA浓度在0.04975~1.5254 mmol/L范围内呈良好的线性关系,相关系数R 2=0.9980,检出限为0.045 mmol/L。采用标准加入法对尿液进行检测,加标回收率为96.9%~122.8%。该研究有望用于接触CS_(2)相关人员尿液中TTCA的现场快速检测。

Ca^(2+)共掺杂LaPO_(4)∶Tb^(3+)荧光材料的水热合成与性能

采用水热法合成碱土金属Ca^(2+)共掺杂LaPO_(4)∶Tb^(3+)纳米荧光材料,通过X射线粉末衍射(XRD)、荧光光谱等对所合成样品的物相结构和荧光性能进行分析。研究了反应体系pH值和Ca^(2+)的物质的量掺杂量等对样品物相结构及荧光性能的影响进行分析。结论表明:采用水热法所合成的样品均为纯相的单斜晶系独居石结构,在反应体系pH值=2和Ca^(2+)的掺杂量为5.0%(摩尔分数)的条件下合成的样品荧光效果最好,在545 nm处表现出Tb^(3+)的特征绿光。

一种基于SGI和DNA探针的CYP2C19*2、*3基因多态性检测的免标记荧光传感器研究

目的建立基于SGI和DNA探针的CYP2C19*2、*3基因多态性检测的免标记荧光传感器,为CYP2C19*2/CYP2C19*3的多态性检测提供新的方法。方法应用Primer express 3.0进行CYP2C19*2、*3的两个位点的检测探针设计;建立和优化实验体系;用突变序列、错配序列对所建立方法的特异性、准确性进行评价;将所建立荧光传感体系用于模拟样本进行检测对其实际适用性进行评价。结果所建立的荧光传感体系对于CYP2C19*、*3目标序列具有较高荧光响应,且对于CYP2C19*2、*3各基因型具有不同的荧光响应,即可以准确地检测出CYP2C19*2、*3野生型、突变杂合型、突变纯合型;且所建立体系具有较较高的稳定性及可重复性。结论本研究所建立的荧光传感器具有高灵敏性、高准确性、高稳定性,可为临床CYP2C19*2、*3多态姓检测提供新思路。

基于T碱基错配非标记荧光法检测Hg2+的新方法

目的建立一种高选择性的、非标记、操作简单的检测Hg2+的荧光分析方法。方法利用紫外可见吸收光谱法,在260 nm波长下测吸光度,对DNA进行定量分析,准确测定实验所用DNA片段的浓度;利用荧光光谱法,在激发波长为445 nm,扫描范围为455~650 nm下,检测单碱基T/T错配的双链DNA探针加入核黄素和Hg2+前后,核黄素的荧光信号的变化。结果单碱基错配的双链DNA能有效检测10~200 nM Hg2+。该体系的荧光比率(F/F0)与Hg2+浓度具有良好的线性关系,其线性方程为F/F0=0.0009C(nmol/L)+0.0049,相关系数r2=0.9930,检出限为3.3 nM(S/N=3)。相对标准偏差(RSD)小于1.37%;样品回收率为100.8%~103.3%。结论该方法可用于环境水样中Hg2+的测定。

外源Ca^(2+)对模拟微重力环境中鱼腥藻细胞质膜透性和光合特性的影响

以鱼腥藻为材料 ,研究了外源Ca2 +对模拟微重力环境中微藻细胞膜透性的影响。实验结果表明 :提高培养基中的Ca2 +浓度可减轻由模拟微重力造成的膜透性增大 ,有助于稳定细胞膜结构和功能。同时 ,外源Ca2 +降低了藻细胞光系统Ⅱ (PSⅡ )的光化学效率 (以荧光参数Fv/Fm表示 )下降的幅度 ,表明外源Ca2 +对模拟微重力环境下鱼腥藻细胞光合作用的损伤 ,有良好的防护效应。

皮质酮对原代培养的海马神经元及其Ca^(2+)/CaMKII的影响

在培养液中加入 10 7、10 6和 10 5浓度(mol/L)的皮质酮,采用MTT染色测定、Fura 2 /AM的荧光标记以及Western印迹的方法,观察了不同浓度的皮质酮作用下海马神经元形态学和细胞存活率的变化以及胞浆内游离钙离子浓度 [Ca2+ ]i和CaMKII表达的变化规律, 探讨其对原代培养的大鼠海马神经元及其Ca2+ /CaMKII的影响和可能的机制。结果发现: 10 6、10 5浓度的皮质酮对海马神经元的形态学影响较大,与对照组比较,细胞存活率明显降低; [Ca2+ ]i分别为 113. 1022±16. 9716、155.3794±20. 7727;CaMKII的表达也明显减少;三者的变化均显著 (P<0. 01 ),而 10 7浓度的皮质酮对上述指标影响不大 (P>0.05)。此外,相关性分析表明: [Ca2+ ]i和CaMKII的表达呈现负相关(P<0. 05)。以上结果提示,皮质酮对大鼠海马神经元的作用存在浓度依赖效应,浓度越高,对大鼠海马神经元的损伤越大,同时也验证了皮质酮是啮齿类动物的主要的应激激素。

铅对小鼠海马[Ca^(2+)]的影响及L型钙通道的作用

目的 探讨铅对分离的小鼠海马细胞内游离钙的影响及其及L型钙通道的作用。方法 采用低浓度胰蛋白酶消化法分离小鼠海马细胞 ,并以莹光指标剂 (Fura 2 )作Ca2 + 荧光探针 ,用双波长荧光法测定海马细胞 [Ca2 + ] i。结果 铅可致分离的小鼠海马细胞 [Ca2 + ] i 升高 [由静息时的 (2 0 3 4± 10 86)nmol L升至 (4 2 3 3± 19 2 6)nmol L] ,而不论胞外是否有钙 ;铅可抑制钾诱发海马细胞 [Ca2 + ] i 升高 ,尼莫地平可加强这种抑制作用 ,而BayK864 4则可部分消除这种抑制作用。结论 铅可致分离的小鼠海马细胞 [Ca2 + ] i 升高作用与胞内钙库释放有关 ;铅的抑制钾诱发海马细胞 [Ca2 + ] i 升高作用与其抑制L型钙通道有关。