二硫键和Ca2+结合残基对重组酱油曲霉碱性蛋白酶的影响

以PDB code:3f7o.1.A蛋白酶作为模板对酱油曲霉碱性蛋白酶(Alkaline protease,Ap)进行同源建模,对模拟的Ap结构分析可知,Ap中无二硫键,结合了1个Ca^2+.分别对预测的Ap二硫键和Ca^2+结合残基进行突变,获得增加二硫键的Y34C-R123C、L178C-T252C、Y34C-R123C/L178C-T252C和Ca^2+结合位点的T179G、D200G、T179G-D200G共6个突变.分别将这些突变基因电转至毕赤酵母KM71中,获得重组菌株;对重组菌株诱导表达,分离纯化突变型Ap,并对其稳定性进行分析.结果表明,Y34C-R123C突变型、L178C-T252C突变型与野生型Ap的表达量差异不显著;在40℃以下,Y34C-R123C突变型比野生型Ap具有更强的热稳定性;T179、D200被突变为甘氨酸后,不利于Ap正确折叠,不能成功表达.