Ca^(2+)载体A23187对受精失败人类成熟卵母细胞的补救激活作用

目的 :观察Ca2 + 载体A2 31 87对受精失败人类成熟卵母细胞的补救激活及激活后的胚胎发育情况。方法 :收集常规体外受精 (IVF)及卵浆内单精子注射 (ICSI)后 2 4h仍无受精征象的成熟卵母细胞作为研究对象 ,5μmol/LCa2 + 载体A2 31 87中处理 5min,观察第二极体排出及原核形成情况 ,激活后卵母细胞在体外继续培养 2d。结果 :IVF组及ICSI组卵母细胞激活率分别为 64 9% (2 4 / 37)和 73 2 % (30 / 4 1 )。ICSI组受精失败卵母细胞激活后主要表现为二极体二原核 (2PB +2PN) (80 % ,2 4 / 30 ) ,而IVF组仅有 2 0 %的被激活卵母细胞表现为 2PB +2PN ,两组间差异具极显著 (P <0 0 1 )。 31个 2PN卵母细胞继续培养 ,2 5个发生分裂 ,1 1个发育到 2 - 4细胞 ,8个发育到 4 - 8细胞 ,6个发育到 8-细胞以上阶段。结论 :Ca2 + 载体A2 31 87能够有效地激活ICSI后受精失败卵母细胞恢复受精并继续发育成胚胎。

钙和钙离子载体A23187对水稻早期胚胎离体发育的影响

研究了不同浓度的钙(Ca2+)和钙离子载体A23187对水稻早期胚胎离体发育的影响。结果表明:(1)Ca2+对授粉后3～5d水稻胚胎离体发育的调控具有时间和浓度效应。培养基中不含Ca2+或Ca2+浓度较高(10-1mol/L)时,3d原胚离体分裂和生长完全受到抑制;4～5d早期分化胚受到一定程度的影响;而Ca2+浓度为10-3mol/L时,不同时期的水稻胚胎均表现出最佳的生长速度和最高的离体胚胎发生频率;在相同的钙浓度条件下,胚龄越大,胚胎发生频率及总诱导频率越大。(2)A23187影响水稻胚胎的离体生长和形态发生:胚胎越小,影响越大;浓度越高,抑制作用越强。

OC-116基因表达载体构建及其对鸡子宫上皮细胞Ca^(2+)浓度和脂质指标的影响

本研究旨在探究OC-116基因过表达对长顺绿壳蛋鸡子宫上皮细胞Ca^(2+)浓度和脂质指标的影响。构建pcDNA3.1(+)+OC-116+Flag表达载体并转染至分离培养的鸡子宫上皮细胞中,通过Flag标签检测试剂盒检测OC-116基因的过表达量,用Fluo-3/AM钙离子荧光标记法检测Ca^(2+)浓度,用脂质指标试剂盒检测细胞内的脂质含量。结果显示:OC-116基因过表达量与Ca^(2+)呈显著正相关,与高密度脂蛋白胆固醇(HDL)呈极显著正相关,与总胆固醇(TCHO)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)呈显著负相关;Ca^(2+)与HDL呈极显著正相关,LDL与HDL呈极显著负相关。本研究结果揭示了OC-116基因能调控鸡子宫上皮细胞的Ca^(2+)浓度和脂质的代谢,为深入阐释鸡子宫上皮细胞中钙和脂质的分泌路径提供理论基础。

心肌细胞的Na^+/Ca^(2+)交换

心肌细胞的正常功能依赖于细胞内的钙离子平衡,而心肌细胞膜上的Na^+/Ca^(2+)交换载体(NCE)是调节细胞内钙离子平衡的主要途径之一。NCE是一种双向转运载体,既可将细胞内的Ca^(2+)转运到细胞外,又可将细胞外的Ca^(2+)转运到细胞内,因而在心肌舒张和收缩过程中具有重要的意义。

Ca^(2+)和cGMP介导的信号转导对大鼠成骨肉瘤细胞株UMR-106C/EBPβ表达的影响

目的:观察Ca2+和cGMP介导的信号转导对大鼠成骨肉瘤细胞株UMR-106的C/EBPβ表达的影响。方法:以Ca2+载体A23187、cGMP类似物CPT-cGMP及CaM阻断剂KN-62等药物作用UMR106细胞株,用WesternBlotting方法检测C/EBPβ的表达。结果:A23187作用后,C/EBPβp35和C/EBPβp20的表达量在一定时间内随着作用时间的延长而增多;CaM-PK抑制剂KN-62可明显抑制A23187的这一作用;且CPTcGMP可使A23187的这一效应增强。结论:Ca2+/CaMPK和cGMP/PKG介导的信号转导能促进UMR-106细胞C/EBPβp35和C/EBPβp20的表达,并呈一定的协同作用。

TRPM7干扰载体修复低氧/复氧致大鼠心肌细胞系H9C2损伤

目的研究瞬时受体电位通道7(TRPM7)干扰载体对低氧大鼠心肌细胞系(H9C2)修复功能的影响及其机理。方法建立H9C2心肌细胞低氧/复氧模型,构建TRPM7干扰表达载体转染H9C2细胞,用RT-qPCR与Western blot检测H9C2细胞低氧诱导因子(HIF1-α)和TRPM7的表达,流式细胞计量术检测胞内钙离子水平([Ca^2+]i)和细胞凋亡,确定TRPM7对H9C2心肌细胞的修复作用。结果H9C2细胞转染TRPM7干扰载体后,细胞的HIF1-α和TRPM7表达显著下降(P<0.05),[Ca^2+]i降低及凋亡率减少(P<0.05)。结论TRPM7干扰载体可能通过PI3K/Akt通路对低氧H9C2心肌细胞有显著的修复作用。

人干细胞生长因子Ca^(2+)依赖糖识别结构域缺失突变体的重组表达及生物学活性的初步探讨

本文作者已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞。这一点与在Ca2+依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同。本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能。由于该突变体序列GC含量较高,因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达。通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在。利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能。研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性。据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用。

铁离子对Caco-2细胞内钙离子转运的影响及钙离子浓度变化与细胞凋亡关系的研究

目的 研究细胞外铁离子(Fe3+)浓度变化对钙离子(Caco 2)细胞内Ca2+转运的影响及细胞内钙离子 浓度升高与Caco 2细胞凋亡的关系。 方法 采用激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞技术进行观察与检测。 结果 (1)利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察发现,随着Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少(DFO终浓度为100～ 300μmol L),Ca2+向细胞内的转运量增加;而随着细胞外Fe3+浓度的增加(FAC终浓度为10～100μmol L),Ca2+向细 胞内的转运呈降低趋势;(2)经A23187和Fluo 3 AM处理后Caco 2细胞的存活率较高,达90%以上(用荧光素二醋酸 酯检测);(3)A23187升高Caco 2细胞的胞内Ca2+浓度,呈剂量依赖性;经流式细胞技术(FCM)检测发现胞内Ca2+浓度 增加具有诱导Caco 2细胞凋亡的作用。 结论 Caco 2细胞外Fe3+浓度的减少有促进Ca2+向细胞内转运的作用, 但胞外Fe3+浓度增加时有抑制Ca2+向胞内转运的作用;胞内Ca2+浓度增加对Caco 2细胞凋亡具有诱导作用。

糖皮质激素对于活化RBL-2H3表达IL-5的影响

目的:探讨糖皮质激素对于活化RBL-2H3(简称RBL)表达白细胞介素5(IL-5)的影响。方法:利用抗原和钙离子载体A23187分别激活RBL表达IL-5,通过总RNA提取、逆转录和半定量PCR研究加入糖皮质激素后对于RBL活化表达IL-5的影响。结果:经A23187活化的RBL,加入10-7mol/L地塞米松后,其IL-5表达量降低到对照的9%,加入10-6mol/L氢化可的松后,其IL-5表达量降低到对照的8.5%。经抗原活化的RBL,加入10-6mol/L地塞米松后,其IL-5表达量降低到对照的12%,加入10-6mol/L氢化可的松后,其IL-5表达量降低到对照的9%。结论:糖皮质激素对于活化RBL表达IL-5具有极大的抑制作用,提示糖皮质激素在临床上治疗哮喘的作用与其抑制肥大细胞表达IL-5存在一定关系。

钙离子载体激活卵母细胞对胚胎发育和妊娠结局的影响

目的:探讨Ca^(2+)载体A23817激活对既往ICSI助孕中出现胚胎结局不良的患者胚胎发育和临床妊娠结局的影响。方法:募集2019年1月至2021年7月于无锡市妇幼保健院生殖医学中心行ICSI助孕中出现胚胎发育缓慢或停滞、囊胚形成率低的患者60例,再次ICSI助孕时采用相同的促排方案,并给予Ca^(2+)载体进行激活。患者前次周期的胚胎情况和妊娠结局作为对照组,比较前后两个周期的胚胎卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率及临床妊娠结局。结果:前后两周期的受精卵率无明显差异(78.5%vs 76.2%),激活组的胚胎卵裂率(95.4%vs 88.1%)、可移植胚胎率(54.8%vs 26.5%)、优质胚胎率(30.3%vs 16.7%)和囊胚形成率(30.8%vs 5.8%)均较对照组显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.01)。激活组的种植率(42.9%vs 8.9%)、血HCG阳性率(69.2%vs 28.1%)、临床妊娠率(53.8%vs 12.5%)和活产率(46.2%vs 0)均较对照组显著提高,而流产率较对照组明显下降(14.3%vs 100%),差异均有统计学意义(均P<0.01)。激活组活产的25例新生儿均未见出生缺陷。结论:Ca^(2+)载体激活能明显改善患者的胚胎质量,促进胚胎卵裂和囊胚形成,改善患者的临床妊娠结局并提高活产率。

A23187和EGTA对光周期诱导菊花成花及其过程中叶片Ca^(2+)分布和碳水化合物的影响

以切花菊品种‘神马’为试材,研究光周期诱导菊花成花过程中Ca2+载体A23187和Ca2+螯合剂EGTA处理对花芽分化及其过程中叶片Ca2+分布和蔗糖、可溶性糖及淀粉含量变化的影响.结果表明:对照叶片Ca2+含量在花芽未分化期(Ⅰ)处于较低水平,而在花芽分化启动期(Ⅱ)迅速增加并达到高峰,之后下降;Ca2+亚细胞定位表明,在未分化期(Ⅰ)Ca2+沉淀主要分布在液泡、细胞壁和细胞间隙中,细胞质内较少,而在花芽分化启动期(Ⅱ)细胞质内积累大量的Ca2+沉淀.A23187处理的菊花花芽分化开始和结束时间比对照分别提前2d和3d,叶片Ca2+含量比对照显著增加;EGTA处理的叶片Ca2+含量比对照显著减少,花芽分化开始和结束时间分别比对照推迟4d和8d;A23187和EGTA处理的叶片Ca2+在花芽分化启动期(Ⅱ)均向细胞质流入并密集.A23187处理的蔗糖和可溶性糖含量在处理2d时达到峰值,比对照达到峰值的时间提前2d,与Ca2+达到峰值的时间一致,而EGTA处理的蔗糖和可溶性糖含量在处理2d时没有明显变化,8d时才迅速增加达到峰值,即所有处理的蔗糖、可溶性总糖含量在花芽分化启动期(Ⅱ)均增加并达到高峰,之后有所减少,但其在整个花芽分化过程均高于光周期诱导前的含量;对照和A23187处理的淀粉含量在处理2d时开始减少,而EGTA则在处理8d后开始减少,至花芽分化结束所有处理的淀粉含量均保持较低水平(低于诱导前).表明Ca2+和碳水化合物参与了光周期诱导的菊花成花过程.

钙离子载体A23187激活卵母细胞在卵胞质内单精子注射中的应用

目的分析Ca^2+载体A23187对卵胞质内单精子注射(ICSI)受精失败或受精低下患者受精及胚胎发育的影响。方法回顾性自身对照研究分析2010年1月至2018年1月期间在中山大学附属第六医院生殖医学研究中心,因前次ICSI受精失败或低下[双原核(2PN)受精率≤30%],再次行ICSI助孕时采用Ca^2+载体A23187激活的43名患者资料。根据前次受精情况将患者分为受精失败和受精低下组、射出精子组和睾丸精子组,激活周期与既往ICSI周期自身对照。结果受精失败、受精低下、睾丸精子和射出精子各组激活周期的2PN受精率显著高于既往ICSI周期(分别为41.9%比0,P<0.001;44.3%比16.5%,P<0.001;36.5%比13.5%,P=0.004;43.1%比11.1%,P<0.001);受精低下组和射出精子组激活周期每周期可移植胚胎数和优质胚胎数较既往周期提高(P均<0.05);激活周期最终获得9例健康活产婴儿。结论Ca^2+载体A23187辅助激活能够提高既往ICSI受精失败或低下患者的受精率,并能改善使用射出精子ICSI患者的胚胎情况及临床结局。

添加物对精子体外获能的影响及其分子机制

获能是哺乳动物精子的成熟过程和受精的必要前提,获能液中添加物从不同方面影响精子获能;本文阐述了肝素、Ca2+载体A23187、葡萄糖、孕酮、咖啡因等添加物对精子体外获能的影响及其作用机制。

水稻Ca2+依赖性核酸酶融合蛋白的构建、纯化及酶活性分析

为了进一步探究水稻(Oryzasativa)Ca^2+依赖性核酸酶基因OsCaN的功能,本研究通过PCR克隆出OsCaN,并将其插入到带有GST标签的原核表达载体pGEX-6p-3中。成功构建了pGEX-6p-3-OsCaN1、pGEX-6p-3-OsCaN3、pGEX-6p-3-OsCaN4原核表达载体,再将其转化到大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导表达融合蛋白。利用蛋白亲和层析柱对重组蛋白进行纯化并通过SDS-PAGE进行电泳检测,随后对核酸酶的酶活性进行鉴定。可以得到GST-OsCaN融合蛋白并检测出目的蛋白相对分子量约为64kD、65.5kD和82.5kD,同时确定了水稻OsCaN1、OsCaN3以及OsCaN4基因是钙离子依赖性核酸酶。本研究为后续分析水稻Ca^2+依赖性核酸酶OsCaN基因的生物学功能提供理论参考。

两种激活方案对辅助生殖技术中未受精卵母细胞的激活效果比较

目的:观察2种不同激活方案对辅助生殖技术中未受精的成熟卵母细胞的激活效果及其胚胎发育情况。方法:收集常规IVF及ICSI后48h移植当日仍未受精的成熟卵母细胞,分别采用"Ca2+载体A23187联合6-甲基嘌呤(6-DMAP)"(Ca+6D)和"氯化锶联合6-DMAP"(Sr+6D)2种方案进行激活处理,观察原核形成情况;将激活后的卵母细胞继续体外培养3～5d,观察胚胎发育情况。结果:Ca+6D组的激活率为80.5%(29/36),显著高于Sr+6D组的47.8%(22/46)(P<0.05)。Ca+6D组激活的29个卵母细胞中有15个表现为2PN,占51.7%;Sr+6D组被激活的22个卵母细胞中有10个表现为2PN,占45.4%,组间无统计学差异(P>0.05)。激活的胚胎继续培养,Ca+6D组的卵裂率为48.3%(14/29),2个发育到2～4-细胞,6个发育到5～8-细胞,6个发育到>8-细胞阶段,最终获得4个桑椹胚,1个囊胚;Sr+6D组的卵裂率为31.8%(7/22),2个发育到2～4-细胞,4个发育到5～8-细胞,1个发育到>8-细胞阶段。结论:2种激活方案均能激活辅助生殖技术中未受精卵母细胞,并继续发育形成胚胎。激活方案"Ca2+载体A23187联合6-DMAP"与"SrCl2联合6-DMAP"相比,激活率及激活胚胎的发育结局,前者优于后者,可能是更适合辅助生殖技术中未受精卵母细胞的激活方案。