Ca^（2＋）／CaMPKⅡ与脑缺血兴奋毒性关系的研究

采用大鼠海马脑片体外缺血模型，观察了“缺血”或谷氨酸及氯胺酮对海马脑片Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响，同时观察了缺血对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（１）Ｃａ￣（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性随“缺血”时间的延长而逐渐下降，缺血１０，２０和３０ｍｉｎ，酶活性分别为对照组的６３％，４４％和２９％（１０ｍｉｎ，Ｐ＜０．００２；２０和３０ｍｍ，Ｐ＜０．００１），提示该酶对缺血非常敏感。（２）单纯过量外源性谷氨酸作用３０ｍｉｎ，能引起酶活性显著下降到仅为对照组的２４％，提示脑缺血时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（３）海马脑片在体外缺血３０ｍｉｎ时，谷氨酸在胞外的堆积增加２倍多（从１２８±２０升高到４３１±７４ｎｍｏｌ·ｍｇ￣（－１）ｐｒｏ·ｍｉｎ￣（－１），ｎ＝６）。（４）氯胺酮对“缺血”和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，但其拮抗作用显著不同，前者可使酶活性恢复至对照的６２％，后者高达９２％。说明脑缺血引起酶活性下降不仅与ＮＭＤＡ受体有关，而且与其它因素有关。

可溶性和颗粒性Ca^（2＋）／CaM PKⅡ对脑缺血与再灌注敏感程度差异性的研究

研究了蒙古沙土鼠脑缺血和再灌注时１０００００×ｇ离心的大脑皮质可溶性和颗粒性Ｃａ（２＋）／ＣａＭＰＫⅡ活性变化的规律性及差异性。实验结果为：（１）随着脑缺血时间的增加，两部分酶活性均逐渐降低，但可溶性酶活性比颗粒性酶活性下降得更快。（２）随着脑缺血后再灌注时间的延长，两部分酶活性均逐渐升高，但可溶性酶活性比颗粒性酶活性上升得更快。结果表明，可溶性酶比颗粒性酶对脑缺血与再灌注更敏感，该酶活性的变化反映了脑缺血的状态，是脑缺血的重要生物化学指标，可用以研究缺血性脑损伤机制和治疗。

多巴胺对大鼠海马和新纹状体脑片Ca^(2+)/CaM PK Ⅱ活性的影响

目的观察多巴胺（ＤＡ）对Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响。方法采用大鼠海马、新纹状体脑片体外培养模型，以３２Ｐ掺入法测定Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性。结果（１）单纯外源性ＤＡ引起Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性显著下降；海马、新纹状体脑片引起最大抑制作用的ＤＡ浓度分别是５００、１０μｍｏｌ／Ｌ。（２）酶活性随ＤＡ作用时间的延长逐渐下降；海马脑片１００μｍｏｌ／ＬＤＡ作用２０ｍｉｎ酶活性方有显著下降，而新纹状体脑片１０μｍｏｌ／ＬＤＡ的作用５ｍｉｎ酶活性即有显著下降。结论ＤＡ诱导海马、新纹状体Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性的抑制，有一定的浓度依赖性和时间依赖性；新纹状体对ＤＡ的作用比海马更为敏感。

MK801拮抗脑缺血导致的Ca^(2+)/CaMPKⅡ活性抑制

目的研究脑缺血兴奋毒性与Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ的关系。方法采用离体孵育的大鼠海马脑片制备“缺血”模型。采用３２Ｐ标记，滤纸片吸附法测定Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性。结果①Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性随“缺血”时间延长而降低，“缺血”３０ｍｉｎ可降至正常的１６．４％；②单纯过量外源性谷氨酸作用３０ｍｉｎ可导致Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性降低；无胞外Ｃａ２＋时，谷氨酸导致的酶活性抑制程度不如有胞外Ｃａ２＋时显著；③ＭＫ８０１对“缺血”导致的Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性抑制有部分拮抗作用，２５μｍｏｌ／ＬＭＫ８０１可使“缺血”３０ｍｉｎ的Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性恢复至正常的４３．８％。结论脑缺血导致的Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性抑制可被ＭＫ８０１部分拮抗，说明其活性抑制与ＮＭＤＡ受体介导的兴奋性毒性作用有关。

大鼠海马脑片缺氧诱导Ca^(2+)/CaM PKII活性抑制机理的研究

采用大鼠海马脑片体外缺氧模型，观察了Ca2+和氯胺酮对海马脑片Ca2+／CaMPKⅡ活性的影响，同时观察了缺氧对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（1）有钙或无钙培养时，酶活性随缺氧时间的延长均下降，但前者比后者酶活性下降更显著，提示外ca2+在神经元缺氧损伤中起重要作用。（2）海马脑片在体外缺氧30min，谷氨酸在胞外的堆积增加2倍多。（3）单纯过量外源性谷氨酸能引起酶活性显著下降，提示脑缺氧时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（4）氯胺酮对缺氧和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，说明脑缺氧引起酶活性下降与NMDA受体介导有关。我们的结论是：脑缺氧时该酶活性的抑制是与下列途径有关：谷氨酸→NMDA受体→Ca2+→Ca2+靶酶。

谷氨酸诱导大鼠海马脑片Ca^（2＋）／CaM PK Ⅱ活性的抑制作用

目的研究外源性谷氨酸对海马脑片Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响及氯胺酮的保护作用，同时研究缺氧对神经元外谷氨酸堆积的影响。方法采用体外培养的大鼠海马脑片研究这些作用。结果（１）海马脑片在体外缺氧３０ｍｉｎ，谷氨酸在胞外的堆积增加２倍多；（２）单纯过量外源性谷氨酸能引起酶活性显著下降，仅为对照组的２４％，提示脑缺氧时酶活性的抑制与兴奋毒性有关；（３）氯胺酮对单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制有明显的拮抗作用，说明脑缺氧引起酶活性下降与ＮＭＤＡ受体介导有关。结论脑缺氧时该酶活性的抑制与下列通路有关：谷氨酸→ＮＭＤＡ受体→Ｃａ２＋→Ｃａ２＋靶酶。

氯胺酮对大鼠海马脑片缺氧诱导Ca^（2＋）／CaM PK Ⅱ活性抑制的拮抗作用

目的研究Ｃａ２＋和氯胺酮对海马脑片Ｃａ２＋／ＣａＭＰＫⅡ活性的影响。方法采用大鼠海马脑片体外缺氢模型进行实验，结果（１）有钙或无钙培养时，酶活性随缺氧时间的延长均下降，但前者比后者酶活性下降更显著，提示外Ｃａ２＋在神经元缺氧损伤中起重要作用；（２）氯胺酮对缺氧所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用，说明脑缺氧引起酶活性下降与ＮＭＤＡ受体介导有关。结论脑缺氧时该酶活性的抑制与下列通路有关：ＮＭＤＡ受体→Ｃａ２＋→Ｃａ２＋靶酶。

加压素(4-8)对大鼠脑内Ca^(2+)/CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ自身磷酸化的影响

大鼠皮下注射加压素（AVP）（4-8）1h后，大脑皮层中Ca2+／CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）自身磷酸化程度与对照组比较增高192％，P＜0.001；海马中增高40％，P＜0．05。CaMKⅡ的自身磷酸化程度依赖于Ca2+及CaM的浓度。在用抗CaMKⅡα单克隆抗体对给药1h组样品和对照组样品进行免疫印迹检测时，发现皮下注射AVP（4-8）1h后，大脑皮层中CaMKⅡα亚基的蛋白量没有明显差异。AVP（4－8）的拮抗剂ZDC（C）PR可以明显阻断AVP（4-8）的作用，表明AVP（4-8）刺激CaMKⅡ的活化是通过受体介导的信号转导过程。

体温对沙鼠前脑缺血/再灌注Ca^(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ活性变化的影响

目的和方法 :本文以蒙古沙土鼠双侧颈动脉夹闭 (BCAO)形成前脑缺血模型 ,观察不同体温 (3 6.5℃、3 0 .0℃、3 9.0℃ )对脑缺血 /再灌注海马、皮质、纹状体、小脑Ca2 +/CaMPKⅡ活性变化的影响。结果 :①除小脑外 ,海马、皮质、纹状体Ca2 +/CaMPKⅡ活性在缺血后均有不同程度下降 ,该下降对缺血过程中体温变化十分敏感 :如分别于 3 6.5℃、3 0 .0℃、3 9.0℃时同样缺血 10min ,海马酶活性分别为对照组的 3 2 .2 %、10 1.3 %、9.1% ;②持续一定时间的低体温再灌注可显著促进海马、皮质、纹状体该酶活性的恢复 :如 3 6.5℃和 3 0 .0℃再灌注相同时间后 ,海马酶活性分别为对照组的 5 1.3 %和 5 3 .2 % (4h ,P >0 .0 5 )、5 8.0 %和 68.9% (8h ,P <0 .0 5 )、67.4 %和 84 .1% (16h ,P <0 .0 5 )。结论 :低体温可显著保护脑缺血 /再灌注缺血敏感组织Ca2 +/CaMPKⅡ活性 ,这可能与其保护缺血性脑损伤关系密切。

慢性染铅对海马CA1区LTP及α-CaMKⅡ活性的抑制性影响

目的:探讨慢性染铅对海马CA1区长时程增强(LTP)及钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(-αCaMKⅡ)活性的影响。方法:用同心圆电极刺激海马的Schaffer侧支,于CA1区用细胞外玻璃电极记录单脉冲刺激引起的锋电位群(PS),观察对照组及不同剂量染铅组大鼠于高频刺激(HFS)前后PS幅值的变化;同时以磷酸化抗体,用Western blots方法检测海马CA1区-αCaMKⅡ活性。结果:HFS后,对照组和低、中、高剂量染铅组的幅值分别为各自的HFS前的162.5%、105.2%、86.8%、83.0%,染铅组PS幅值变化率明显低于对照组(P<0.01);以对照组-αCaMKⅡ活性为100,则低、中和高剂量染铅组活性分别为62.0±3.7、50.8±4.0、43.3±4.1,和对照组相比P<0.01,具有显著性差异。结论:慢性染铅可抑制CA1区LTP形成,而这种抑制作用可能与铅使-αCaMKⅡ活性降低密切相关。

DA耗竭对缺血性纹状体CaM KⅡ活性及磷酸化的影响

为了探讨 DA耗竭对纹状体神经元缺血性损伤的保护作用是否与 Ca M K 的参与有关 ,建立了损毁大鼠黑质 +四动脉阻断前脑缺血的复合模型 ,采用同位素 3 2 P掺入法、放射自显影和 Ca M K 及磷酸化Ca M K (p- Ca M K )免疫组织化学方法 ,研究了 DA耗竭对纹状体缺血 Ca M K 活性、自身磷酸化、含量和细胞内分布的影响。发现损毁黑质、耗竭 DA可逆转由缺血引起的纹状体 Ca M K 酶活性及免疫活性下降 ,减少该酶自身磷酸化状态。这些作用可能是损毁黑质保护纹状体缺血性损伤的机制之一。

水稻叶片Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶的纯化和活性测定

通过高速离心、( NH4) 2 SO4沉淀、琼脂糖凝胶过滤和 Ca M- sepharose4B亲和层析 ,从 HPGMR( 5 8S)叶片中初步纯化出 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶 .纯化的 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶线性梯度电泳 ,亚基分子量约为 5 5× 10 3.在 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的标准反应体系中 ,存在过量的 ATP,提取磷酸化反应剩余的 ATP,用叶绿体 Mg2 + - ATP酶分解 ATP,最后用复合孔雀绿测定无机磷 ,从而来计算 Ca2 + / Ca M依赖性蛋白激酶的活性 .实验结果表明 ,该酶活性是依赖 Ca2 + 和 Ca M的 ,并且 EGTA和

CaMKⅡ和SynGAP在大鼠脑缺血中的神经保护作用

目的:研究脑缺血诱导的SynGAP丝氨酸磷酸化、CaMKⅡ与SynGAP的相互作用及内在机制。方法:利用大鼠四动脉结扎全脑缺血模型,通过免疫沉淀和免疫印迹的手段观察CaMKⅡ自身磷酸化、从胞浆转位到胞膜以及SynGAP的丝氨酸磷酸化,并利用脑室注射CaMKⅡ的特异性抑制剂观察上述指标的变化。结果:脑缺血导致胞膜部分总的CaMKⅡ和磷酸化的CaMKⅡ的水平均显著升高,CaMKⅡ与SynGAP的结合显著高于对照组,SynGAP的丝氨酸磷酸化水平也显著升高;CaMKⅡ的抑制剂KN62能抑制CaMKⅡ的自身磷酸化、SynGAP的丝氨酸磷酸化以及CaMKⅡ和SynGAP的相互结合,但对胞膜CaMKⅡ的水平没有影响。结论:脑缺血诱导的SynGAP丝氨酸磷酸化是由CaMKⅡ所催化的,SynGAP发生丝氨酸磷酸化后导致激活MAPK信号通路,在缺血过程中可能为一种细胞应激反应,对神经元起保护作用。

Ca^(2+)和cGMP介导的信号转导对大鼠成骨肉瘤细胞株UMR-106C/EBPβ表达的影响

目的:观察Ca2+和cGMP介导的信号转导对大鼠成骨肉瘤细胞株UMR-106的C/EBPβ表达的影响。方法:以Ca2+载体A23187、cGMP类似物CPT-cGMP及CaM阻断剂KN-62等药物作用UMR106细胞株,用WesternBlotting方法检测C/EBPβ的表达。结果:A23187作用后,C/EBPβp35和C/EBPβp20的表达量在一定时间内随着作用时间的延长而增多;CaM-PK抑制剂KN-62可明显抑制A23187的这一作用;且CPTcGMP可使A23187的这一效应增强。结论:Ca2+/CaMPK和cGMP/PKG介导的信号转导能促进UMR-106细胞C/EBPβp35和C/EBPβp20的表达,并呈一定的协同作用。

两种Ca^（2＋）依赖性蛋白激酶对脑缺血的敏感性研究

以蒙古沙土鼠（ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ）双侧颈动脉结扎为缺血模型，研究了缺血１０ｍｉｎ及复流６ｈ后的大脑皮质可溶性及颗粒性ＰＫⅡ和ＰＫＣ这两种蛋白激酶的活性变化。发现缺血１０ｍｉｎ后可溶性和颗粒性ＰＫⅡ的活性分别下降为对照组的５９．１％和６２．５％，而复流６ｈ后又恢复至对照组的８６．３％和８４．２％；可溶性和颗粒性ＰＫＣ的活性分别下降为对照组的８４．４％和８４．５％，复流６ｈ后恢复至对照组的９０．４％和８９．４％。结果提示，ＰＫⅡ比ＰＫＣ对脑缺血更敏感。

基于“肝肾相关”理论从Ca2+-CaM/CaMKⅡ-CREB信号转导途径探析黑逍遥散防治阿尔茨海默病的可行性

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的增龄性神经退化性疾病,随着社会老龄化发展趋势而迅猛增加,严重威胁着人民群众健康,如果缺乏有效防治措施,将给社会经济和医疗保障体系造成巨大冲击。研究发现细胞信号转导异常是许多疾病发生的关键环节,细胞信号转导理论被广泛应用于阐明中医脏象实质和中医药作用机制的研究。"肝肾相关"是"五脏相关"理论的核心板块之一,适用于复杂疾病发病机制的阐释,解释多证候的相关性,及指导临证处方用药。黑逍遥散作为本研究组基于肝肾相关理论防治AD的首选复方,可通过疏肝养血、健脾益肾,通脑络利神窍而发挥防治AD作用。本文基于"肝肾相关"理论,从中医学角度阐述了AD的发病机制,通过查阅文献并结合前期研究,提出了从Ca2+-钙/钙调蛋白依赖性蛋白(CaM)/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)细胞信号转导途径防治AD的方法与思路。

谷氨酸在模拟高原梭曼中毒性脑损伤的作用研究

目的 探讨谷氨酸 (Glutamicacid ,Glu)在缺氧复合梭曼中毒脑损伤的作用机制。方法 采用氨基酸分析和放免技术 ,研究高原缺氧、梭曼中毒单一与复合致伤后 1 2、2 4、4 8h脑组织Glu和CaM含量的变化以及钙 /钙调蛋白激酶Ⅱ (Ca2 +/CaM PKⅡ )活性的影响及其机制。结果 缺氧复合梭曼中毒组脑组织Glu、CaM含量在中毒后 2 4h明显高于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组 ;缺氧中毒组脑组织Ca2 +/CaM PKⅡ活性在中毒后 2 4h明显低于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组 ;而N 甲基 D 天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂地佐环平 (MK 80 1 )和钙通道拮抗剂尼莫地平 (Nimodipine)可对抗这种改变。结论 高原缺氧复合梭曼中毒后Glu的兴奋毒引起脑损伤和Ca2 +/CaM PKⅡ的活性下降 ,主要由NMDA受体介导和胞外Ca2 +内流增加有关。

心力衰竭大鼠心肌β_3肾上腺素受体表达及其对钙离子相关调节蛋白的作用

目的研究心力衰竭(HF)大鼠心肌β3肾上腺素受体(beta3-adrenergic receptors,β3-AR)表达情况及对钙离子相关调节蛋白的作用。方法以正常大鼠作对照组,皮下注射生理盐水;实验组大鼠皮下注射异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO),常规饲养8w。造模成功后实验组随机分为3组,激动剂组给予尾静脉注射β3-AR激动剂BRL37344,抑制剂组给予尾静脉注射β3-AR抑制剂SR59230A,HF组给予生理盐水。用药8w后行心脏彩超、RT-PCR法检测心肌组织钙调蛋白(CaM)、钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、肌内质网Ca2+-ATP酶异构体2a(SERCA2a)的mRNA表达。结果①HF组较对照组β3-ARmRNA表达水平增高,CaM、CaMKⅡ、SERCA2amRNA表达水平减低(均P<0.05)。②与HF组相比较,激动剂组β3-ARmRNA水平表达增加,CaM、CaMKⅡ、SERCA2a表达进一步减少(均P<0.05)。③抑制剂组β3-ARmRNA表达水平较对照组减少,CaM、CaMKⅡ、SERCA2a较对照组减低,但较HF组增加(均P<0.05)。结论β3-AR激动剂减低衰竭心肌CaM、CaMKⅡ、SERCA2a的mRNA表达,导致心功恶化,β3-AR抑制剂则相反,可延缓HF进展,预示β3-AR抑制剂在药物治疗HF中的应用前景。

钙在嗜铬细胞瘤细胞缺氧性脑损伤中的作用研究

目的观察缺氧后大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞内游离钙的浓度(犤Ca2+犦i)、环磷酸腺苷(cAMP)、钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白激酶II(Ca2+/CaM-PKII)的变化。方法采用放免技术,从细胞水平进一步观察缺氧对PC12细胞的毒性、细胞内犤Ca2+犦i变化,cAMP、CaM和Ca2+/CaM-PKII的变化。结果缺氧组PC12细胞cAMP、CaM含量在缺氧后24h明显高于正常对照组;Ca2+/CaM-PKII活性明显低于正常对照组。结论犤Ca2+犦i、cAMP、CaM和Ca2+/CaM-PKII在缺氧PC12细胞损伤机制中起了重要的作用。

血管性痴呆病因病机与发病机制研究概况

血管性痴呆(vascular dementia,VD)属中医学"呆病"、"痴证"等范畴,为肾精亏虚-髓海不足、痰、浊(水湿)-瘀血等蒙蔽(阻)脑窍、玄府郁阻、浊毒内侵、本虚标实、气血亏虚、三焦气化失司、伏邪内生-损害元神、脏腑功能失调、络脉学说;病理机制包括中枢胆碱能、兴奋性氨基酸、氧自由基、神经细胞凋亡、细胞和分子(海马Ca2+、钙调素CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ-CaMPKⅡ,内皮素-1-ET-1降钙素)、炎性反应、遗传机制、危险等。中医虽然对血管性痴呆发病原因论述较多,但机理尚未明确,未能达成共识,亦有待于临床与实验进一步检验,对呆病诊断也需扩展其内涵。认为现代医学虽在科研上取得一些研究成果,但也存在一定问题,未来应统一实验标准、设计严谨科研方案等,指导临床VD治疗,判断治法方药优劣性及稳定性。