低温胁迫下Ca^(2+)-CaM信使系统对三尖杉幼苗保护酶活性的影响

用一定浓度的CaCl2、LaCl3、EGTA、CPZ等4种效应剂根施三尖杉1年生幼苗,在25℃下预处理10 d后,移入-3℃下进行低温胁迫处理,分别在胁迫后24、48、72、96 h时测定过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化酶(SOD)等3种保护酶的活性。结果表明:根施外源CaCl2结合低温处理可增强三尖杉幼苗3种保护酶的活性,缓解低温处理过程中保护酶活性的下降;但三尖杉幼苗内源保护酶活性可被EGTA、LaCl3以及CPZ等3种效应剂抑制。说明三尖杉幼苗抗冻性的形成受Ca2+-CaM信号传导途径的调控。

Ca^(2+)-CaM系统与甜菜抗丛根病生理特性的关系

为研究信号分子钙在甜菜抗丛根病过程中的作用,用三种从不同位点阻断Ca2+信号途径的抑制剂,即Ca2+螯合剂EGTA(乙二醇双四乙酸)(5 mmol/L)、Ca2+通道阻遏剂LaCl3(5 mmol/L)和CaM拮抗剂W7(N-氨乙基-5-氯-1-磺胺酰萘)(0.3 mmol/L),分别处理种植于甜菜丛根病三级病土中的甜菜,测定其抗氧化酶、O2-、H2O2及可溶性蛋白质的含量,结果表明:EGTA(5 mmol/L)、LaCl3(5 mmol/L)和W7(0.3 mmol/L)可降低超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性,增加O2-的积累和H2O2的含量,降低了可溶性蛋白质的含量。说明Ca2+-CaM系统与甜菜抗丛根病性相关。

Ca^(2+)-CaM系统对野生苦菜耐盐抗氧化系统的调控

用两种从不同位点阻断Ca2+信号途径的抑制剂,即Ca2+螯合剂EGTA(乙二醇双四乙酸)(5 mmol/L)和CaM拮抗剂W7(N-氨乙基-5-氯-1-磺胺酰萘)(0.3 mmol/L),分别处理盐胁迫(0.5 mmol/L)下的野生苦菜幼苗,测定其抗氧化系统中酶的活性,H2O2、Pro和可溶性蛋白的含量。结果表明,EGTA(5 mmol/L)、W7(0.3 mmol/L)可降低超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,提高H2O2的含量,降低Pro和可溶性蛋白的含量,说明Ca2+-CaM系统与野生苦菜耐盐性密切相关。

Relationship Between Ca ^(2+)-CaM and Ethylene-Induced PG Activity in Tomato Fruit

Polygalacturonase (PG) was studied during ripening and senescence of postharvest tomato fruit at pink stage at low and normal temperature. The results showed that the PG activity increased, then decreased during ripening and senescence of tomato. Low temperature inhibited but ethylene enhanced PG activity. Ethylene also enhanced calmodulin content, which was dependent on Ca 2+concentration in cell. When EGTA(Ca 2+chelator), verapamil(Vp) and LaCl 3(Ca 2+channel blockers), trifluoperazine and chloropromaize (two CaM antagonisms) were used to treat tomato fruit at green mature stage with ethylene, they could reverse ethylene-induced increase in PG activity, but Vp, chloropromaize (CPZ), trifluoperazine (TFP) could not directly influence PG activity, which indirectly indicated that influx of Ca 2+ from the extracellular space including the cell wall via the Ca 2+ channel localized in plasma membrane and CaM were required for ethylene-induced PG activity increase and that ethylene signal transduction may be related to Ca 2+CaM messenger system.

NO和H_2O_2依赖Ca^(2+)/CaM信号调控马铃薯花青素积累

以不同块茎颜色马铃薯品种陇薯8号、陇薯7号、LC310-2和山东彩肉为材料,研究外源NO、H2O2、NO+H2O2处理对马铃薯块茎花青素合成及其信号物质Ca2+-ATPase和CaM的影响。结果表明:外源NO和H2O2处理后,4个基因型马铃薯薯皮和薯肉花青素积累,Ca2+-ATPase活性升高,CaM含量增加,其效果为NO+H2O2>H2O2>NO>水(CK),并且花青素的积累量与Ca2+-ATPase活性和CaM含量均呈正相关,其平均决定系数达0.9194和0.8859。说明NO和H2O2对马铃薯花青素合成具有一定的促进作用,而细胞Ca2+/CaM信号发挥了NO和H2O2对马铃薯花青素合成诱导的信号调节。

Ca2＋·CaM信使系统参与小麦抗叶锈病反应的初步研究

研究Ca2+.CaM是否参与小麦抗叶锈病反应的过程,为更深入了解小麦抗叶锈病的反应机制奠定基础。采用离体培养的方法测定小麦种子经CaM拮抗剂TFP(三氟拉嗪)、CPZ(氯丙嗪)和W-7(N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalene sulfonamide)以及CaCl2预处理后小麦叶片接种叶锈菌后在不同时间点的酶活性。另外用实时定量PCR的方法检测小麦接种亲和小种和非亲和小种后CaM不同亚型基因的表达情况。试验结果表明:小麦叶片接种非亲和性叶锈菌后,TFP、CPZ和W-7浸种处理抑制了过氧化物酶(POD)、丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性的上升;小麦叶片接种亲和性叶锈菌后,CaCl2预处理加剧了过氧化物酶(POD)、丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性的上升。这说明Ca2+.CaM信使系统可能在小麦抗叶锈病过程中起着重要作用,并且不同的CaM亚型可能调控不同的抗病途径。

胞外及胞内Ca^(2+)共同参与拟南芥中茉莉酸诱导的钙动员

【目的】探究茉莉酸(Jasmonic acid,JA)诱导的钙动员的来源及钙调素(CaM)在JA信号通路中的作用。【方法】以拟南芥(Arabidopsis thaliana columbia)为材料,采用不同类型的离子通透性通道抑制剂(或拮抗剂)预处理拟南芥叶肉细胞,利用激光共聚焦显微镜检测其对JA诱导的[Ca2+]cyt升高的影响;同时还利用上述拮抗剂、钙调素(CaM)拮抗剂处理10d的拟南芥幼苗,采用Northern blot方法检测了其对JA诱导的VSP表达的影响。【结果】胞内及胞外钙离子共同参与JA诱导的钙动员,JA诱导的Ca2+通过CaM或CaM相关蛋白进一步传递JA信号。【结论】质外体钙离子的流入和胞内钙库中钙离子的释放均参与JA诱导的钙离子动员,Ca2+可能通过CaM或CaM相关蛋白传递JA信号,进一步诱导JA反应基因的表达。

八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内[Ca^(2+)]_i和CaM活性的影响

目的观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠皮质、海马、纹状体神经细胞内[Ca2+]i和CaM活性的影响。方法剂量递增法(10~50 mg·kg-1)连续5 d皮下注射吗啡建立吗啡依赖模型,并给予腹腔注射纳洛酮(5 mg·kg-1)催促戒断,采用流式细胞术检测大鼠皮质、海马、纹状体[Ca2+]i和CaM活性的变化。结果 (1)与盐水对照组相比,吗啡依赖组大鼠皮质、海马、纹状体内[Ca2+]i和CaM活性均明显升高;纳洛酮催促戒断后[Ca2+]i和CaM活性较吗啡依赖组均明显降低;(2)CCK-8及CCK-1受体拮抗剂L-364,718、CCK-2受体拮抗剂LY-288,513均使吗啡戒断大鼠海马和纹状体内[Ca2+]i和CaM活性明显升高,但皮质内[Ca2+]i和CaM活性无明显变化。结论 CCK-8及其受体拮抗剂对吗啡依赖大鼠戒断反应的作用可能与其对相关脑区神经细胞内[Ca2+]i和CaM活性的调节有关。

脑缺血生化机制的研究——(Ⅰ)脑缺血Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶活性的变化

本文报道了小鼠断头缺血和蒙古沙土鼠双侧颈动脉结扎缺血模型的形成,鉴定了40,000×g脑匀浆上清液中Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶。在上述两种脑缺血模型中,Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶活性随缺血时间延长而降低。断头缺血1分钟酶活性开始降低;缺血10分钟和20分钟,酶活性分别降低至正常组的43％和33％。双侧颈动脉结扎5、10、20、30分钟,酶活性分别降低为正常组的90％、62％、51％和47％。提示:脑缺血时,Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶活性降低可能是一种脑神经系统功能紊乱的重要表现。

欧李果实发育中CaM和Ca^(2+)-ATPase活性的动态变化

【目的】探讨CaM和Ca2+-ATPase对欧李果实发育成熟的调节作用机制。【方法】以野生欧李果实为材料,测定欧李果实发育成熟过程中CaM含量和Ca2+-ATPase活性的动态变化。【结果】欧李果实发育前期Ca2+-ATPase活性持续升高,果实发育成熟后期,其活性逐渐降低;果实中CaM含量随果实发育呈持续增加趋势,在果实发育前期和后期均存在一明显上升期。【结论】果实中CaM含量与Ca2+-ATPase活性变化与欧李果实周年发育特征和钙含量动态变化相对应。

电针对吗啡戒断大鼠NAc脑区Ca^(2+)浓度和CaM活性的影响

目的:研究电针对吗啡戒断大鼠空间学习记忆能力及对NAc脑区Ca2+浓度和CaM活性的影响。方法:采用逐日递增法,背部皮下注射吗啡5天后立即给予纳洛酮催促戒断,建立吗啡戒断大鼠模型,然后对戒断症状评分。采用Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力;采用流式细胞技术检测不同组别的细胞内Ca2+浓度、CaM的变化。结果:电针组大鼠逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.01);电针组与模型组比较显著增加穿越平台次数(P<0.01)。结论:电针治疗可明显改善吗啡戒断后大鼠空间学习和记忆能力;电针组大鼠脑内Ca2+浓度、CaM较模型组明显升高。

牛脑Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的纯化和鉴定

通过一系列层析法,首次从牛脑纯化得到胶凝电泳匀一的Ca^(2+)/CaM PKⅡ。凝胶过滤法测定全酶分子量为550kD,SDS-PAGE法测定亚基分子量为55kD,推测牛脑Ca^(2+)/CaM PK Ⅱ由十个相同的亚基组成。该酶活性绝对依赖于Ca^(2+)和CaM,以63kD PDE同工酶为底物,其AC_(50)分别为0.85μmol/L和0.18μmol/L;以酪蛋白为底物,其AC_(50)分别为0.22μmol/L和0.06μmol/L。牛脑Ca^(2+)/CaM PK Ⅱ旣能催化63kD PDE同工酶等多种蛋白或酶磷酸化,又能进行自身磷酸化。该酶催化63kD PDE同工酶最大磷酸参入量为1mol/mol亚基。磷酸化型63kD PDE同工酶的Ca^(2+)的AC_(50)高于非磷酸化型。

渗透胁迫下CaM合成与胞质Ca^(2+)关系初步研究

通过外源添加Ca^(2+)、EGTA和Verapamil(异博啶),初步研究了渗透胁迫下CaM合成与Ca^(2+)的关系。渗透胁迫下,0mmol/L、20 mmol/L Ca^(2+)、EGTA和Verapamil处理均提高小麦幼苗根叶CaM含量。结果表明:渗透胁迫下,胞质Ca^(2+)浓度升高和降低均促进CaM的合成,Ca^(2+)参与了CaM的合成。

小鼠脑Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的鉴定及苄普地尔对其酶活力的抑制作用

用DE_(52)、磷酸纤维素和Sephaery S—300柱层析从小白鼠脑中提纯了Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ并进行了鉴定。凝胶过滤法测定全酶分子量为55万,在SDS-PAGE中显示出两条区带,其亚基分子量分别为5万和5.7万。该酶活力依赖于Ca^(2+)和CaM,AC_(50)分别为28μmol/L和2.2μmol/L。苄普地尔对酶有抑制作用,IC_(50)约为250μmol/L。

植物免疫应答过程中Ca^(2+)及CaM/CML的功能

钙离子是一个多功能的第二信使,在植物响应各种生理刺激时,Ca2+参与调节植物的多种生长发育和胁迫适应过程。在这些过程中,Ca2+信号带有特异性标签,通过Ca2+结合蛋白及其下游靶蛋白感知不同刺激并翻译成响应的细胞反应。钙调素(CaM)和钙调素类蛋白(CML)是Ca2+主要的感受器,通过调节不同靶蛋白的活性调控多种细胞功能。最近在植物对抗病原菌的防卫反应中有关Ca2+/CaM信号转导系统的研究取得了一定进展。重点关注植物免疫应答过程中受CaM/CML调控的信号组分的研究,包括参与Ca2+信号产生和Ca2+依赖的表达基因组分调控。

Ca^(2+)调节剂在乙烯催花中对观赏凤梨CaM基因表达特性的调节作用

凤梨科植物乙烯催花技术自1930年代开始使用,效果显著。但凤梨科植物乙烯催花的机理尚不明确。鉴于Ca2+-CaM在多种植物开花过程中具有一定的调节作用,为了研究Ca2+-CaM系统在乙烯诱导凤梨科植物开花中的作用,本文以紫花擎天凤梨成株为试材,通过乙烯分别和Ca2+调节剂(Ca2+促进剂,Ca2+螯合剂和抑制剂)的组合处理植株后,利用RT-PCR和Northern技术分析了CaM基因表达特性的变化。结果表明,乙烯处理的同时,加入Ca2+促进剂,使CaM表达量峰值出现的时间由24h提前到了6h;而加入Ca2+螯合剂和抑制剂,使CaM基因表达量峰值出现的时间延迟到了48h以后。该结果与相应的开花时间进程一致,即加入Ca2+促进剂,使花器官出现的时间提前约5d,而加入Ca2+螯合剂和抑制剂,使花器官出现的时间有不同程度的延迟,表明Ca2+调节剂对CaM表达特性的调节作用对乙烯诱导凤梨开花也有一定的影响。

红花对脑缺血Ca^（2＋）／CaM－PKⅡ活性抑制作用的影响

研究了红花对蒙古沙土鼠脑缺血和再灌注时４００００ｒ／ｍｉｎ离心大脑皮质可溶住Ｃａ２＋／ＣａＭ－ＰＫⅡ活性的影响。实验结果如下：（１）脑缺血１０ｍｉｎ组酶活性为假手组的１３．６％；而缺血前给药组（６．７ｇ红花／ｋｇ体重）酶活性为假手组的７９．４％。（２）红花拮抗脑缺血诱导该酶活性的抑制具有剂量依赖性。（３）脑缺血１０ｍｉｎ后给生理盐水再灌注２ｈ，酶活性恢复至假手术组的９２％，而缺血后给药再灌注不能加速酶活性的恢复。

渗透胁迫下水杨酸诱导的小桐子甜菜碱积累涉及Ca2+/CaM信号

本研究以小桐子幼苗为材料,在水培条件下,研究了外源水杨酸(SA)对PEG 6000胁迫下小桐子幼苗甘氨酸甜菜碱含量、代谢关键酶BADH活性和相关基因表达,以及Ca2+和CaM抑制剂对SA诱导甜菜碱积累的影响。结果表明:外源1.5 mmol/L SA处理可显著提高渗透胁迫下小桐子幼苗的甜菜碱含量、增加甜菜碱合成关键酶BADH的活性,以及上调JcCMO和JcBADH的表达水平。与单独用PEG处理的幼苗相比,SA处理也提高了渗透胁迫下小桐子幼苗的钙调素(CaM)活性。此外,CaCl2处理能增强SA诱导的甜菜碱积累效应,提高BADH的活性和上调JcBADH的表达水平,而Ca2+通道阻断剂LaCl3、CaM抑制剂CPZ和TFP处理得到相反的结果。这些结果表明,外源SA处理可提高渗透胁迫下小桐子幼苗甜菜碱的生物合成能力,且SA诱导的甜菜碱积累过程可能受到Ca2+/CaM信号的调控。

两类钙通道拮抗剂对缺氧大鼠海马脑片Ca^(2+)/CaM PKⅡ活性的影响

用离体孵育的大鼠海马脑片模型，研究了两类钙通道拮抗剂对缺氧海马脑片Ca2+/CaM PKⅡ活性的影响。结果如下：(1)缺氧30min导致大鼠海马脑片Ca2+/CaM PKⅡ活性降至对照组的16.4%；(2)100μmol/L氯胺酮可部分拮抗缺氧导致的酶活性下降，使之恢复至对照组的40.6%；(3)10μmol/L苄丙咯可使缺氧导致的酶活性下降恢复至对照组的35.8%；(4)15μmol/L苄丙咯和50μmol/L氯胺酮联合用药可产生协同作用，使缺氧导致的酶活性下降恢复至对照组的63.8%。由此得出结论：缺氧对海马脑片Ca2+/CaM PKⅡ活性的抑制作用与NMDA受体门控的钙通道和Na+/Ca2+交换通道异常开放有关。

Genistein通过影响Ca^(2+)/CaM/Cav1.2/CaMKⅡ信号通路抑制Aβ_(25-35)诱导的海马神经元损伤

目的探讨植物雌激素染料木素(Genistein,GST)对Aβ25-35引起海马神经元钙超载损伤的抑制作用及其机制。方法本实验分为以下4组:正常对照组,Aβ25-35组,Aβ25-35+Genistein组(Aβ25-35+GST组),Aβ25-35+17β-雌二醇组(Aβ25-35+E2组),通过MTT比色法测定细胞活性,选取Genistein的最适浓度。采用Aβ25-35处理建立海马神经元损伤模型。利用Tuj1染色观察神经元生长状态,激光共聚焦扫描观察Genistein对[Ca2+]i的影响,通过Western blot技术检测Ca M、Cav1.2、p-Ca MKⅡ/Ca MKⅡ蛋白表达的变化。结果 0.3μg/ml Genistein能明显抑制Aβ25-35引起细胞活性降低及[Ca2+]i增加,并能对抗Aβ25-35引起的Ca M,Cav1.2蛋白水平增加及p-Ca MKⅡ减少。结论 Genistein具有拮抗Aβ25-35所致海马神经元钙超载损伤的作用,其作用机制可能与Ca2+/Ca M/Cav1.2/Ca MKⅡ信号通路有关,为Genistein进一步应用于临床治疗神经退变性疾病提供理论依据。