神经型一氧化氮合酶(nNOS)与SUMO连接酶PIAS3相互作用结构基础鉴定

神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在中枢神经系统广泛分布。本课题组前期研究报道,神经活性增强促进神经型一氧化氮合酶SUMO化,继而上调其活性,激活下游ERK1/2信号通路,参与调控兴奋性突触传递。SUMO连接酶PIAS3可通过其N-末端AAs 43~86与nNOS结合,参与介导神经型一氧化氮合酶SUMO化。本文进一步筛选和鉴定nNOS中与PIAS3结合的氨基酸序列,深入研究nNOS与PIAS3相互作用的结构基础。采用分子克隆技术,分别构建nNOS缺失结构域突变体(AAs 1~1396、1~756和1~720)的真核表达载体,然后分别与Myc-PIAS3质粒共转染于COS7细胞。结果显示,AAs 1~720与PIAS3共转染组nNOS-PIAS3的结合水平显著低于其他组;Myc-nNOS(AAs 721~756)化学合成小肽与纯化的His-PIAS3在体外也可相互结合。结果表明,nNOS的AAs 721~756(CaM结合结构域,CaMB)可与PIAS3直接结合。GST pull-down进一步证明,nNOS的CaMB与PIAS3 AAs 43~86可直接结合。构建CaMB-pcDNA3.1真核表达载体,共表达nNOS、Myc-PIAS3和CaMB,CaMB共表达组nNOS-PIAS3结合明显降低。结果提示,CaMB通过竞争结合PIAS3从而干预nNOS与PIAS3的结合。将化学合成的穿膜肽Tat融合的CaMB(Tat-CaMB,5μmol/L)与皮质神经元预孵育1 h,用荷包牡丹碱(bicuculline,50μmol/L)诱导化学性长时程增强(long-term potentiation,LTP)。结果显示,Tat-CaMB可显著逆转bicuculline诱导的ERK1/2磷酸化(活化)水平的升高,与荷包牡丹碱处理组相比,下降了29%(P<0.05)。结果表明,Tat-CaMB可通过干预nNOS-PIAS3结合,进而抑制神经型一氧化氮合酶SUMO化及其下游ERK1/2信号通路的活化。通过上述研究,证明nNOS可通过CaM结合结构域(AAs 721~756)与PIAS3结合,并提供了一种鉴定和验证蛋白质间相互作用结构基础的有效方法。